NY/T 2473-2013
基本信息
标准号： NY/T 2473-2013
中文名称：结球甘蓝品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
NY/T 2473-2013 结球甘蓝品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2473-2013
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标准内容
ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2473—2013
结球甘蓝品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for identification of cabbage varieties--SsR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
范围·
规范性引用文件
仪器设备及试剂
溶波配制
引物·
参照品种及其使用
操作程序
等位基风数据采集
10判定标准·
附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂附录B(规范性附录）
附录 C(规范性附录）
溶液配制
核心克物·
NY/T 2473—2013
NY/T2473—2013
本标雅按照GB/11.12009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能沙及专利本文件的发布机构不承扭识别这些专利的货任本标准由农业部种子管埋局提出，本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)L口，本标雅起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院蔬莱花弃研究所本标准主要起节人庄木，诺菀苑，张扬勇、王庆彪、方智远，杨丽梅、刘玉梅。1范围
NY/T2473—2013
结球甘蓝品种鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定了利用简单重复序列(SSR）分子标记进行结球廿i蓝（BnsicteruceuLvar.下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注且期的引月文件，仅注口期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则3原理
简单重复序列(SSR)分布于结球甘蓝整个基因组的不同位置上不同品种每个位点上重复单位的数Ⅱ及序刻可能不同。中于每个简单重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计对特异孕1物.利用PCR技术对重复序列进行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的也荷效应作用下得到良好的分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。出于不同结球廿监品种遗传组成不同，所以，根据引物DNA序列存在差异或引物结合部位之问的INA片段大小存在差异，即可鉴定结球甘蓝品种，
4仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
5溶液配制
本标准所川试剂为分析纯.所用水应符合GB/T6682中规定的要求。溶液配制方法见附录B，6引物
基本核心引物见附录（。
7参照品种及其使用
参照品种的名称见附录（。在进行等位变异检测时.应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物，注1：多个品种在某一R位点上可能部具有相同的等位变。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后·这些品种也可以代替耐录C中的参照品种使用注2：同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变晕可能不相同·在使用其他来源的参照品种时吨与浪参照品种核对.确认无误店使用。
对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准方法.确定其大小和对应参照品种。8操作程序
8.1样品准备
iiiKAoNiiKAca
NY/T2473—2013
8.1.1送检样品可为种,幼叶或其他组织，8.1.2每份样品中至少随机抽收1C个个休，混合分析。对一致性差的样品，成分别随机抽取20个以上的个体.每个个体单独分析。
8.2DNA提取
提取DNA可采而以下方法：
选取适量(0.2g左右)植物组织置2.0ml离心管中，用液氮仰磨至粉术；a）
离心管中加入700uL预热2%CTAB缓冲液.轻掘混勾；b）
65℃水浴15min，每隔5min轻摇1次：冷却后加入700μL氯仿-异醇（24：1)混合液.混勺5min；d)
12 000 g 离心 15 min;
吸取上清液2mL.的离心管巾，加人700预冷异丙醇，混后放4沉淀1h；g）12 000g离心15min;
弃上清.75%艺醇洗涤后晾干：
加人300μIddH20.6uLRNAae,37C水浴1h；待充分溶解后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度：k）稀释或工作液或20℃保存备用。注：以上为推荐的一种DNA提取方法。所获IDNA质量能够符合PCIR扩增带要的INA提取方法都适用于本标谁。
8. 3PCR 扩增
8. 3. 1 反应体系
反应液体积为20L.反应组分配制见表1。DNA分析仪检测时使荧光标记的正向引物，每和引物的荧光染料种类见附录C
表1PCR扩增反应体系
反应组分
10× Butifer(含氯化获 15 mmr)l/ L)dNIP(2. 5 mnal/ 1. each)
正向引物（10μml/1）
正向引物（10ml/1）
Taq酶(5 U/μet.)
DNA(20 ng/ μL)
注：反应体积可以振据需要调整。8. 3. 2反应程序
终浓度
200umal/
0. 25 jμmol/1
0.25 jμmal/T.
反应体积(μL）
94%预变性4min；94℃变性30s，合适的退火温度30%；72℃延伸45s，共35个循环：72℃延伸7min;4℃保存。退火温度叫根据表C.1推荐的引物退火温度设定。8.4等位基因检测
8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.4.1.1清洗玻璃板
将长、短玻璃板清洗干，去离子水冲洗后晾于。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在长板上涂上0.5mL亲和硅烧T作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液，操作过程中防止两块玻璃板百相污染。
8.4.1.2组装电泳板
待玻璃板彻底十燥斥组装电泳板，并用水平仪调平。8.4.1.3灌胶
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取60mI.G%的变性聚丙烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方式）300uLAPS和60uLTFMFD轻轻混匀.把板的一边抬起，将胶缓缓地灌人。当胶倒底部后将板放置水半，将梳子平端插人适当的位置，聚合1h后用可电泳。灌胶过程中应防止出现气泡，8.4.1.4预电泳
将梳子小心拔出，并把碎胶清埋千净，然后擦下净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加入1TBE。在恒功率80W条件下预电泳20min~-30mins8.4.1.5变性
在PCR产物中加入10uL6×加样缓冲液，混句后，在PCR仪上9C变性5mi1.取出，过速置于碎冰上.冷却 10 min以上
8.4.1.6电泳
颜电泳结束后，将胶面的气泡及杂质吹打干净，将梳子轻轻插人，梳了齿的深度为刚选人胶面约1mm。每一个加样孔点入5μl.样品：80W恒动率电泳至上部的指示带（二511苯青）到达胶板的41斤部（约1.5h)。电泳结束后，小心分开两块玻离板，凝胶会紧贴在长板上。8.4.1.7银染(快速银染法
a）固定：带凝胶长板在固定液中轻轻晃动6min.固定液叫收待用；b)
染色：染色液中轻轻摇晃6min;
漂洗：蒸馏水快速漂洗，30s；
d）显影：显影液中轻轻晃动牵带纹出现.f min-~8min；定影：用回收的固定液定影2minf）漂洗：蒸馏水漂洗1min。
8.4.2DNA分析仪检测
8.4.2.1样品准备
将觉有荧光标记的PC求产物稀释到合适的检测浓度，不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数j以通过预试验确定，一般6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用纯水稀释30倍：TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uI.加入到DNA分析仪专川深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1LL1Z500分子量内标和8.9去商子甲酰胺。除待测样品外，还应同时包括参照品种的扩增产物。将样品在PCR仪上95℃变性5min，立即取出置于冰溶中，冷却10min以上，瞬时离心后，准备上机器进行毛细管电泳。8.4.2.2开机准备
打元DNA分析仪，检查仪器1作状态，更换缓冲液.灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上．打开数据收集软件。
8.4.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输人电泳板名称，选摔适合的程序利电泳板类型，输入样品编号或名称。
8. 4.2. 4运行程序
运行程序。INA分析仪户动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。9等位基因数据采集
9.1数据格式
-iiiKAoNiiKAca
NY/T2473-—2013
样品每个SSR位点的等位基因采用扩增片段大小的形式表示。如同一品神不同个体间等位基因扩增片段人小存在差异，以多数个体共同的等位基圆扩增片段大小表示。9.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位胃与对成的参照品种进行比较，与待测样品相同的参照品种的片段大小即为待测样品该引物位点的等位基因扩增片段大小。9.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件-读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据。通过使用参照品种，消除同型号不同批次间或不同型号1NA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位基因扩增片段大小数据与表C7中的数据。如两者不一致-其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位基内扩增片段数据小去除该系统误差，获得的数据即为待测样品的等位基因扩增片段大小。9.4结果记录
纯合位点的等位基扩增片段数据记录为XXX/XXX.其中XXX为该位点等位基内扩增片段大小：杂合位点的等位基因扩增片般数据记录为XXX/YYY，其中XXX、YYY分别为该位点上两个不同的等位基因，小片段数据在前.人片段数据在后；无效位点的等位基因数据记录为0/0。示例1：
一个品种的一个SSR位点为纯台位点，等位基因扩增片段大小为120bp.则该品种在该位点.上的等位基因扩增片段数据记录为120/120。
示例2：
一个品种的一个SSR位点为杂合位点.两个等位基因扩增片段大小分别为120bp.126bp.则该品种在该位点上的等位基因增片段数据记录为120/126，10判定标准
品种鉴定包括对两个或两个以上的品种同时进行检测（\直接比较\）和对待测品种进行检测后利币其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（\数据库比较”)两种情况。后者也适用十新品种测试中利SSR标记选择近似品种的情况，
10.1直接比较
用附录C中20对基本核心引物检测.获得待测品种在这些引物位点的等位基因数据.利用这些数据进行品种间比较：
a）品种间差异位点数2,判定为不同品种；b）品种间差异位点数=1,判定为相近品种：c）品种间差异位点数一0.判定为疑同品种。对下1)和)的两种情况.应按照GB/T19557.1给出的原则逊行由间试验，确定品种间在形态性状上是否存在明显差异。
10.2数据库比较
先用附录C中20对基本核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位基因数据、利这些数据和数据库中品种进行比较：n）品种问差异位点数多2.判定为不同品种：b）品种间差异位点数一1.判定为相近品种；）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种。对于b)和)的两种情况，将这些相近品种或既同品种与待测品种按照11.1的方法逆行鉴定，A.1主要仪器设备
A. 1. 1 PCR扩增仪。
A.1.2测序电泳档及配套的制胶附件，A.1.3高压电泳仪。
A.1.4水平摇床。
胶片观察灯箱。
附录A
【规范性附录】
主要仪器设备及试剂
电于天平（量程为1000mg、100g、600g)微量移液器，
磁力搅拌器。
高压淡菌锅.
酸度计。
台式高速离心机。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
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DNA分析仪：基于毛细管电泳.有13NA片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸A. 1. 14
的差异。
5水浴锅或金属浴：控温精度士1℃。A. 1. 15
6冰箱：最低温度20℃。
紫外分光光度计：波长260nm及280nml。A. 1. 17
A.2试剂
A.2.1乙二胺四乙酸钠，
A.2.2Tris碱。
A.2.3盐酸。
A.2.4氢氧化钠，
Taq DNA 聚合酶 loX Buller.
A.2.6四种脱氧核酸:(dATP,dTTP,dCTP,dGTP),A. 2. 7
Tag DNA聚合酶，
A.2.8 SSR引物。
A.2.9矿物油。
A.2.10去离了甲酰胺。
A.2.11溴酚蓝。
iiiKAoNiiKAca
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甲苯背FF。
A.2.13燕糖。
甲叉双丙烯酰胺。
内烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和硅烧。
剥离硅烧。
光水乙醇。
四甲基乙…胺(TEMED)
过硫酸铵。
冰醋酸
硝酸银，
甲醛溶液。
CTAB。
氯仿，
异戊醇。
异丙醇。
琼脂糖。
液氮。
T.17. -500分子量内标。
POP-4胶
DNA分析仪专用电泳缓冲液
B.1DNA 提取溶液的配制
附录B
【规范性附】
溶液配制
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B.1. 10. 5 mol/ILED)TA溶液:185. 1EITA-Na·?H(溶于 800mL水中,用固体 Na()H调 pH希8.0,定容至1000 niL.,高压灭菌，B.1.21mol/I.TrisHCl溶液：60.55gTris碱溶丁适量水中，加HCI调pH至8.0.定穿至500mL、高压灭菌。
B.1.30.5mol/LHCl液：25mL浓盐酸（36%-~38%）).硼水定容带500mL。B.1.42%CTAR:CTAB20g.NaCl81.816g、PVP20g,1mol/1.Tris-HCI济液(pH8.0)100mL0. 5 mol/L EDTA 溶液(pH8. 0)40 mL,定容至 1 000 mLB.1.55mol/1.NacI溶液：146名固体Nat1溶于水中，加水定容至500mI.。B.1.6氯仿一异戊醇（24：1)：取240ml.氯仿和1CmL异戊醇，混匀。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1SSR引[物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均为10mol/L的储存液.各取10μl.混合。注：丁粉配制前应首先快速离心B.2.26×加样缓冲液：去离子甲酰胺49mL，0.5mo1/L的EDTA溶液（pII8.0)1mL.漠酚蓝0.125g,二苯青0.125g，蔗糖40 g。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.14C%PAGE胶：两烯酰胺190g和叉双内烯酰胺10定容至500mLB.3.26.0%PAGE胶：尿素420g、10XTBE缓冲液100mL、40%PAGE胶150mL.定容至1000mL
B.3.3Binding缓冲液：49.75ml.无水乙醇和250μT.冰醋酸.加水定容至50trL。B.3.4亲和硅烷I作液：在1ml.Binding级冲液中加入5μLBindling原液，混勾。B.3.5剥离硅烷工作液;2%甲基二氯硅烷。B.3.610%过硫酸铵济液：10g过硫酸铵加水定容至100rL.分装到2m.离心管中，在4℃最多保存2周~3周，若需长期保存应置于一20℃环境下。B.3.710×TEE缓冲液：Tris碱108g.硼酸55g、0.51nol/LFDTA溶液37mL.定容至10001ril.nB.3.81XTBE级冲液：10XTBE缓冲液500ml.加水定容5000L。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液：200mlL无水乙醇、10nl.冰醋酸，加水定容至1000mL。B.4.2染色液：3硝酸银、3ml.醛，加水定容至2000ml.B.4.3显影液：2000mL蒸馏水中加人30g氢氧化钠和4ml.甲醛。了
-iiiKAoNhiKAca
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核心引物见表C.1。
染色体
BoE188
BnE607
BoE162
BcE718
BoE002
BoE882
BoEs99
BoEs79
BoE761
附录C
【规范性附录]
核心引物
囊 C. 1核心引物目录
引物序列(5'→3'）
F:LGAGATGGCGAGGAAACA
R,CACATAACCCAAATACCCAAATEA
F: TTTATTCACAACGATTLAACTAAL:R.CGGTACGTA.TK\TT
F, AGCAGCTTCGTTCAATLFCC
R;CGGCAGKGTATACCTTCACA
F: TCGAATAAAGAAGAAAAAGAAGA
R: TAATCCTGKTAAGAGTAGT
F:ACTACCCICICCGTTTACTTTACA
R:GCCCCATAGCTTTCTEAA
F;CAAGAAACGGACGTGGTGAAAG
R: TLICGUGTATGGGGCTGTCT
F:CGTCACGGIGGCGCTITATTTT
R: ACGACGTCGCCGCALTTGAAC
F: TCTCGCCAIGGCTGATAAG
R:TCGGGGCGIIGATTCTGTCTCT
F:CCGCTTCITCCIIGCUTTCTT
R:TICGCCAGTAGATCCCCGTAATG
F: TCCCCACCCCCAAAAAGAGA
R: AALGAGCCATCCGAAGAAGAGG
F:GCGGGGACTL'TACCTCTA
R:AGCAGCTCAGCATACAAG
F,CATTCAGCGACTICCTTCAAACTT
R:GGLGCACTICITCCCCTGTA
荧光标记
5'TAMRA
5'6 -FAM
5'TAMRA
5'6 FAM
5TAMRA
S'TAMRA
:TAMRA
退火等位
温度湛因
参照品种
秋：号
秋1号
北i8号
品8号
中H21
券廿2号
中192
豫尘早熟牛心
中甘 16
京卡一号
瑞甘
甘 55
中甘 18号
豫生早热牛心
秋甘「
春甘2号
京—号
西园四号
中甘 21
EoE723
BoE209
BoH237
BoEi34
PoE731
RoFo51
BoE917
染色体
表C.1(续）
引物序列(5\→3')
F:CGTTGAGGCCGAGAGTGAGAG
R:ATGGACGCCGGAAATGAGAA
F:ATCTATCCATCCGCTCGTCA
R: AACCCCTATICGCTTACTCC
F:CCGACAATGGCTGGAGTAGG
R:GATAAGCLGGTAGACATAAGGAG:
F:AATCOCGAAAAGAGCGAAAC
R:CTGGGGAGOXGAGAAGGAG
F:CTCTTATTTGTTGTAGGGCTITTA
RETIGGAGATGACIGACTG
F: TCATCGAAAGAAATCAGAGG
R:ACAGGGAGAAAGAAAAAGAGAwwW.bzxz.Net
F:GAGTCTTGTCIICTTETTCC
R:AGTCGCCATTATTAACACCTCTA
F: AACAACLTTICCTGACAC
R: AAAAACCAAAGAACTACAAAATA
荧光标记
S'HIFK
5'TAMRA
5'6-FAM
注：等位基因片段大小为在ABI313CXL序议惊用循存炭光标记扩增后获得iiKAoNiKAca
NY/T 2473—2013
退火等位
参照品种
西园四号
春廿2号
秋H4号
京丰—号
苏8号
中甘18
京丰一号
巾廿18号
苏甘20号
西园四号
苏甘：号
豫甘号
中营18号
中甘8号
中甘192
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结球甘蓝品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for identification of cabbage varieties--SsR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
范围·
规范性引用文件
仪器设备及试剂
溶波配制
引物·
参照品种及其使用
操作程序
等位基风数据采集
10判定标准·
附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂附录B(规范性附录）
附录 C(规范性附录）
溶液配制
核心克物·
NY/T 2473—2013
NY/T2473—2013
本标雅按照GB/11.12009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能沙及专利本文件的发布机构不承扭识别这些专利的货任本标准由农业部种子管埋局提出，本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)L口，本标雅起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院蔬莱花弃研究所本标准主要起节人庄木，诺菀苑，张扬勇、王庆彪、方智远，杨丽梅、刘玉梅。1范围
NY/T2473—2013
结球甘蓝品种鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定了利用简单重复序列(SSR）分子标记进行结球廿i蓝（BnsicteruceuLvar.
简单重复序列(SSR)分布于结球甘蓝整个基因组的不同位置上不同品种每个位点上重复单位的数Ⅱ及序刻可能不同。中于每个简单重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计对特异孕1物.利用PCR技术对重复序列进行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的也荷效应作用下得到良好的分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。出于不同结球廿监品种遗传组成不同，所以，根据引物DNA序列存在差异或引物结合部位之问的INA片段大小存在差异，即可鉴定结球甘蓝品种，
4仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
5溶液配制
本标准所川试剂为分析纯.所用水应符合GB/T6682中规定的要求。溶液配制方法见附录B，6引物
基本核心引物见附录（。
7参照品种及其使用
参照品种的名称见附录（。在进行等位变异检测时.应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物，注1：多个品种在某一R位点上可能部具有相同的等位变。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后·这些品种也可以代替耐录C中的参照品种使用注2：同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变晕可能不相同·在使用其他来源的参照品种时吨与浪参照品种核对.确认无误店使用。
对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准方法.确定其大小和对应参照品种。8操作程序
8.1样品准备
iiiKAoNiiKAca
NY/T2473—2013
8.1.1送检样品可为种,幼叶或其他组织，8.1.2每份样品中至少随机抽收1C个个休，混合分析。对一致性差的样品，成分别随机抽取20个以上的个体.每个个体单独分析。
8.2DNA提取
提取DNA可采而以下方法：
选取适量(0.2g左右)植物组织置2.0ml离心管中，用液氮仰磨至粉术；a）
离心管中加入700uL预热2%CTAB缓冲液.轻掘混勾；b）
65℃水浴15min，每隔5min轻摇1次：冷却后加入700μL氯仿-异醇（24：1)混合液.混勺5min；d)
12 000 g 离心 15 min;
吸取上清液2mL.的离心管巾，加人700预冷异丙醇，混后放4沉淀1h；g）12 000g离心15min;
弃上清.75%艺醇洗涤后晾干：
加人300μIddH20.6uLRNAae,37C水浴1h；待充分溶解后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度：k）稀释或工作液或20℃保存备用。注：以上为推荐的一种DNA提取方法。所获IDNA质量能够符合PCIR扩增带要的INA提取方法都适用于本标谁。
8. 3PCR 扩增
8. 3. 1 反应体系
反应液体积为20L.反应组分配制见表1。DNA分析仪检测时使荧光标记的正向引物，每和引物的荧光染料种类见附录C
表1PCR扩增反应体系
反应组分
10× Butifer(含氯化获 15 mmr)l/ L)dNIP(2. 5 mnal/ 1. each)
正向引物（10μml/1）
正向引物（10ml/1）
Taq酶(5 U/μet.)
DNA(20 ng/ μL)
注：反应体积可以振据需要调整。8. 3. 2反应程序
终浓度
200umal/
0. 25 jμmol/1
0.25 jμmal/T.
反应体积(μL）
94%预变性4min；94℃变性30s，合适的退火温度30%；72℃延伸45s，共35个循环：72℃延伸7min;4℃保存。退火温度叫根据表C.1推荐的引物退火温度设定。8.4等位基因检测
8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测8.4.1.1清洗玻璃板
将长、短玻璃板清洗干，去离子水冲洗后晾于。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。在长板上涂上0.5mL亲和硅烧T作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液，操作过程中防止两块玻璃板百相污染。
8.4.1.2组装电泳板
待玻璃板彻底十燥斥组装电泳板，并用水平仪调平。8.4.1.3灌胶
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取60mI.G%的变性聚丙烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方式）300uLAPS和60uLTFMFD轻轻混匀.把板的一边抬起，将胶缓缓地灌人。当胶倒底部后将板放置水半，将梳子平端插人适当的位置，聚合1h后用可电泳。灌胶过程中应防止出现气泡，8.4.1.4预电泳
将梳子小心拔出，并把碎胶清埋千净，然后擦下净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加入1TBE。在恒功率80W条件下预电泳20min~-30mins8.4.1.5变性
在PCR产物中加入10uL6×加样缓冲液，混句后，在PCR仪上9C变性5mi1.取出，过速置于碎冰上.冷却 10 min以上
8.4.1.6电泳
颜电泳结束后，将胶面的气泡及杂质吹打干净，将梳子轻轻插人，梳了齿的深度为刚选人胶面约1mm。每一个加样孔点入5μl.样品：80W恒动率电泳至上部的指示带（二511苯青）到达胶板的41斤部（约1.5h)。电泳结束后，小心分开两块玻离板，凝胶会紧贴在长板上。8.4.1.7银染(快速银染法
a）固定：带凝胶长板在固定液中轻轻晃动6min.固定液叫收待用；b)
染色：染色液中轻轻摇晃6min;
漂洗：蒸馏水快速漂洗，30s；
d）显影：显影液中轻轻晃动牵带纹出现.f min-~8min；定影：用回收的固定液定影2minf）漂洗：蒸馏水漂洗1min。
8.4.2DNA分析仪检测
8.4.2.1样品准备
将觉有荧光标记的PC求产物稀释到合适的检测浓度，不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数j以通过预试验确定，一般6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用纯水稀释30倍：TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uI.加入到DNA分析仪专川深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1LL1Z500分子量内标和8.9去商子甲酰胺。除待测样品外，还应同时包括参照品种的扩增产物。将样品在PCR仪上95℃变性5min，立即取出置于冰溶中，冷却10min以上，瞬时离心后，准备上机器进行毛细管电泳。8.4.2.2开机准备
打元DNA分析仪，检查仪器1作状态，更换缓冲液.灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上．打开数据收集软件。
8.4.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输人电泳板名称，选摔适合的程序利电泳板类型，输入样品编号或名称。
8. 4.2. 4运行程序
运行程序。INA分析仪户动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。9等位基因数据采集
9.1数据格式
-iiiKAoNiiKAca
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样品每个SSR位点的等位基因采用扩增片段大小的形式表示。如同一品神不同个体间等位基因扩增片段人小存在差异，以多数个体共同的等位基圆扩增片段大小表示。9.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位胃与对成的参照品种进行比较，与待测样品相同的参照品种的片段大小即为待测样品该引物位点的等位基因扩增片段大小。9.3毛细管电泳荧光检测
使用DNA分析仪的片段分析软件-读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据。通过使用参照品种，消除同型号不同批次间或不同型号1NA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位基因扩增片段大小数据与表C7中的数据。如两者不一致-其差数即是系统误差的大小。从待测样品的等位基内扩增片段数据小去除该系统误差，获得的数据即为待测样品的等位基因扩增片段大小。9.4结果记录
纯合位点的等位基扩增片段数据记录为XXX/XXX.其中XXX为该位点等位基内扩增片段大小：杂合位点的等位基因扩增片般数据记录为XXX/YYY，其中XXX、YYY分别为该位点上两个不同的等位基因，小片段数据在前.人片段数据在后；无效位点的等位基因数据记录为0/0。示例1：
一个品种的一个SSR位点为纯台位点，等位基因扩增片段大小为120bp.则该品种在该位点.上的等位基因扩增片段数据记录为120/120。
示例2：
一个品种的一个SSR位点为杂合位点.两个等位基因扩增片段大小分别为120bp.126bp.则该品种在该位点上的等位基因增片段数据记录为120/126，10判定标准
品种鉴定包括对两个或两个以上的品种同时进行检测（\直接比较\）和对待测品种进行检测后利币其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（\数据库比较”)两种情况。后者也适用十新品种测试中利SSR标记选择近似品种的情况，
10.1直接比较
用附录C中20对基本核心引物检测.获得待测品种在这些引物位点的等位基因数据.利用这些数据进行品种间比较：
a）品种间差异位点数2,判定为不同品种；b）品种间差异位点数=1,判定为相近品种：c）品种间差异位点数一0.判定为疑同品种。对下1)和)的两种情况.应按照GB/T19557.1给出的原则逊行由间试验，确定品种间在形态性状上是否存在明显差异。
10.2数据库比较
先用附录C中20对基本核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位基因数据、利这些数据和数据库中品种进行比较：n）品种问差异位点数多2.判定为不同品种：b）品种间差异位点数一1.判定为相近品种；）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种。对于b)和)的两种情况，将这些相近品种或既同品种与待测品种按照11.1的方法逆行鉴定，A.1主要仪器设备
A. 1. 1 PCR扩增仪。
A.1.2测序电泳档及配套的制胶附件，A.1.3高压电泳仪。
A.1.4水平摇床。
胶片观察灯箱。
附录A
【规范性附录】
主要仪器设备及试剂
电于天平（量程为1000mg、100g、600g)微量移液器，
磁力搅拌器。
高压淡菌锅.
酸度计。
台式高速离心机。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
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DNA分析仪：基于毛细管电泳.有13NA片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸A. 1. 14
的差异。
5水浴锅或金属浴：控温精度士1℃。A. 1. 15
6冰箱：最低温度20℃。
紫外分光光度计：波长260nm及280nml。A. 1. 17
A.2试剂
A.2.1乙二胺四乙酸钠，
A.2.2Tris碱。
A.2.3盐酸。
A.2.4氢氧化钠，
Taq DNA 聚合酶 loX Buller.
A.2.6四种脱氧核酸:(dATP,dTTP,dCTP,dGTP),A. 2. 7
Tag DNA聚合酶，
A.2.8 SSR引物。
A.2.9矿物油。
A.2.10去离了甲酰胺。
A.2.11溴酚蓝。
iiiKAoNiiKAca
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甲苯背FF。
A.2.13燕糖。
甲叉双丙烯酰胺。
内烯酰胺。
硼酸。
尿素。
亲和硅烧。
剥离硅烧。
光水乙醇。
四甲基乙…胺(TEMED)
过硫酸铵。
冰醋酸
硝酸银，
甲醛溶液。
CTAB。
氯仿，
异戊醇。
异丙醇。
琼脂糖。
液氮。
T.17. -500分子量内标。
POP-4胶
DNA分析仪专用电泳缓冲液
B.1DNA 提取溶液的配制
附录B
【规范性附】
溶液配制
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B.1. 10. 5 mol/ILED)TA溶液:185. 1EITA-Na·?H(溶于 800mL水中,用固体 Na()H调 pH希8.0,定容至1000 niL.,高压灭菌，B.1.21mol/I.TrisHCl溶液：60.55gTris碱溶丁适量水中，加HCI调pH至8.0.定穿至500mL、高压灭菌。
B.1.30.5mol/LHCl液：25mL浓盐酸（36%-~38%）).硼水定容带500mL。B.1.42%CTAR:CTAB20g.NaCl81.816g、PVP20g,1mol/1.Tris-HCI济液(pH8.0)100mL0. 5 mol/L EDTA 溶液(pH8. 0)40 mL,定容至 1 000 mLB.1.55mol/1.NacI溶液：146名固体Nat1溶于水中，加水定容至500mI.。B.1.6氯仿一异戊醇（24：1)：取240ml.氯仿和1CmL异戊醇，混匀。B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1SSR引[物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均为10mol/L的储存液.各取10μl.混合。注：丁粉配制前应首先快速离心B.2.26×加样缓冲液：去离子甲酰胺49mL，0.5mo1/L的EDTA溶液（pII8.0)1mL.漠酚蓝0.125g,二苯青0.125g，蔗糖40 g。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.14C%PAGE胶：两烯酰胺190g和叉双内烯酰胺10定容至500mLB.3.26.0%PAGE胶：尿素420g、10XTBE缓冲液100mL、40%PAGE胶150mL.定容至1000mL
B.3.3Binding缓冲液：49.75ml.无水乙醇和250μT.冰醋酸.加水定容至50trL。B.3.4亲和硅烷I作液：在1ml.Binding级冲液中加入5μLBindling原液，混勾。B.3.5剥离硅烷工作液;2%甲基二氯硅烷。B.3.610%过硫酸铵济液：10g过硫酸铵加水定容至100rL.分装到2m.离心管中，在4℃最多保存2周~3周，若需长期保存应置于一20℃环境下。B.3.710×TEE缓冲液：Tris碱108g.硼酸55g、0.51nol/LFDTA溶液37mL.定容至10001ril.nB.3.81XTBE级冲液：10XTBE缓冲液500ml.加水定容5000L。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液：200mlL无水乙醇、10nl.冰醋酸，加水定容至1000mL。B.4.2染色液：3硝酸银、3ml.醛，加水定容至2000ml.B.4.3显影液：2000mL蒸馏水中加人30g氢氧化钠和4ml.甲醛。了
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核心引物见表C.1。
染色体
BoE188
BnE607
BoE162
BcE718
BoE002
BoE882
BoEs99
BoEs79
BoE761
附录C
【规范性附录]
核心引物
囊 C. 1核心引物目录
引物序列(5'→3'）
F:LGAGATGGCGAGGAAACA
R,CACATAACCCAAATACCCAAATEA
F: TTTATTCACAACGATTLAACTAAL:R.CGGTACGTA.TK\TT
F, AGCAGCTTCGTTCAATLFCC
R;CGGCAGKGTATACCTTCACA
F: TCGAATAAAGAAGAAAAAGAAGA
R: TAATCCTGKTAAGAGTAGT
F:ACTACCCICICCGTTTACTTTACA
R:GCCCCATAGCTTTCTEAA
F;CAAGAAACGGACGTGGTGAAAG
R: TLICGUGTATGGGGCTGTCT
F:CGTCACGGIGGCGCTITATTTT
R: ACGACGTCGCCGCALTTGAAC
F: TCTCGCCAIGGCTGATAAG
R:TCGGGGCGIIGATTCTGTCTCT
F:CCGCTTCITCCIIGCUTTCTT
R:TICGCCAGTAGATCCCCGTAATG
F: TCCCCACCCCCAAAAAGAGA
R: AALGAGCCATCCGAAGAAGAGG
F:GCGGGGACTL'TACCTCTA
R:AGCAGCTCAGCATACAAG
F,CATTCAGCGACTICCTTCAAACTT
R:GGLGCACTICITCCCCTGTA
荧光标记
5'TAMRA
5'6 -FAM
5'TAMRA
5'6 FAM
5TAMRA
S'TAMRA
:TAMRA
退火等位
温度湛因
参照品种
秋：号
秋1号
北i8号
品8号
中H21
券廿2号
中192
豫尘早熟牛心
中甘 16
京卡一号
瑞甘
甘 55
中甘 18号
豫生早热牛心
秋甘「
春甘2号
京—号
西园四号
中甘 21
EoE723
BoE209
BoH237
BoEi34
PoE731
RoFo51
BoE917
染色体
表C.1(续）
引物序列(5\→3')
F:CGTTGAGGCCGAGAGTGAGAG
R:ATGGACGCCGGAAATGAGAA
F:ATCTATCCATCCGCTCGTCA
R: AACCCCTATICGCTTACTCC
F:CCGACAATGGCTGGAGTAGG
R:GATAAGCLGGTAGACATAAGGAG:
F:AATCOCGAAAAGAGCGAAAC
R:CTGGGGAGOXGAGAAGGAG
F:CTCTTATTTGTTGTAGGGCTITTA
RETIGGAGATGACIGACTG
F: TCATCGAAAGAAATCAGAGG
R:ACAGGGAGAAAGAAAAAGAGAwwW.bzxz.Net
F:GAGTCTTGTCIICTTETTCC
R:AGTCGCCATTATTAACACCTCTA
F: AACAACLTTICCTGACAC
R: AAAAACCAAAGAACTACAAAATA
荧光标记
S'HIFK
5'TAMRA
5'6-FAM
注：等位基因片段大小为在ABI313CXL序议惊用循存炭光标记扩增后获得iiKAoNiKAca
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退火等位
参照品种
西园四号
春廿2号
秋H4号
京丰—号
苏8号
中甘18
京丰一号
巾廿18号
苏甘20号
西园四号
苏甘：号
豫甘号
中营18号
中甘8号
中甘192
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