NY/T 2474-2013
基本信息
标准号： NY/T 2474-2013
中文名称：黄瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2474-2013 黄瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2474-2013
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标准内容
ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2474—2013
黄瓜品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for the identification of cucunber varieties-SsR marker method
2013~12-13 发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
范围·
规范性引用文件
3术语和定义
原理．
仪器设备及试剂
试剂和溶液配制
操作程序
等位基因数据采集
结果记录
判定标准
附录A（规范附录）
附录B(规范性附录)
附录（(规范性附录）
附录 D(资料性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制
核心引物
参照品种
NY/T 2474—2013
NY/T2474—2013
本标推按照GB/T1.1--20C9给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本义件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标雄由农业部种子管理局提：本标准出全国植物新品和测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归IF。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花产征究所.农业部科技发展中心本标雅主要起草人：苗晗、张圣平、顾兴芳、王烨、莫青。1范围
黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T 2474—2013
本标准规定了利历简单重复序列（SimpleSequerceRepeals.SSR）分子标记进行黄瓜（CucumissaiuusI.)品种鉴定的试验方法、数据记录格式及判定标准。本标准适用丁黄瓜DNA分了数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文作的应用是必不川少的。凡是注且期的引用文件，仅注口期的版本适用十本义件。凡足不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程GB/T19557.1植物新品种特异性、-敛性和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物Core Primers
核心引物指分布于黄瓜每条染色体工·多态性、稳定性、重复性等综合特性好、作为『NA指纹鉴定优先选用的一套引物。
参照品种Referenctvariety
参照品种指对应于SSR位点不同等位基因的--维品种。参照品种用丁确定待测样品在某个SSR位点上等位基因扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。4．原理
简单重复序列（SSR)）分布十黄瓜整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数日及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守和单拷贝的.闪而可根据其两端的序列设计-·对特异引物，利历PCR技术对重复序列进行扩增，在电泳过程中：PCR产物在电场作门下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分，根据FCR产物的带型差异鉴定黄瓜品种。
5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂名单见附录A，
6试剂和溶液配制
相关溶液配制方法见附录B。
7引物
核心引物名单见附录C。
-iiKAoNhiKAca
NY/T 2474—2013
8操作程序
8.1样品准备
8.1.1对于种子样品的分样和保存，按CB/T3513.2的规定进行。8.1.2每份样品至少检测5个个体，每个个体单独分析。对一致性差的样品应增加检测个休至10个以上.每个个体单独分析。
8.2DNA提取
提供两种DNA提取方法
方法一：选胶植株下胚轴或幼叶30m~40m%置十2.0tmL离心管中，用液氮研磨至粉状：加入700μL2%CTAB预热缓冲液，65℃水浴1h，加人700匙氯伤一异成醇（24：1），下混勾10min，16200g离心10min；吸取上清液加人预先装有70GuL异内醇的1.5ml的离心管巾.上下混匀后放一20℃冰箱30min.16200g离心1Gmir1；弃上清，经70%乙醇洗涤后加人100L超纯水：待充分溶解后备用，适用计露要大量提敢DNA和长期贮荐的情况。方法：选取植株下胚轴或幼叫30ng~4011g置于2.0mL离心管中：而液氮研磨.食粉状.加3JoL0.1mol/LNa)II,沸水加热10rnin.加入等体积超纯水，直接取2.0uL进行SSR扩增，于4℃保存。适用丁高通量快速提取DVA，但DVA浓度较低H不适十长期购存。注：以上为推荐的两种DNA提取方法，所获DVA质量能够符合FCR扩增需要的LINA提取力法都适用于本标谁
8.3PCR扩增
8.3.1标准样品的使用
在进行PCR扩增和等位基因检测时，应同时包括相应的标准样品，不同位点的标准样品的名称见录C。某一位点上具有相同的等位基网的标准样品可能不止，个，在确认这些样品在某一位点上的等位基因人小后，性可将这些样品代替附录心中的标准样品。对于附录（中术包括的等位基因：应按本标准的方法，通过使用DNA分析仪与标准样品同时进行检测确定其大小。同一名称不同来源的标准样品在某一位点上的等位基因可能不相尚，在使用前应与原标准样品进行核对，
注：多个品种在某一位点上可能都具存相同的等位基因，在砸认这些品种某一位点上等位基因大小后,这些品种也可以代誉谢录（的标准样品使，8.3.2反应体系
SSR反应休系，包括基组DNA20.0ng，1×Bufer缓冲液（含Mg2）,dNTP2.5mmol/L，正反向引物各30 ng.Tag 0.5U,其余以超纯水补足。推荐使用15 μuL~-20μL反应体积8.3.3反应程序
94%预变性4min.94℃变性15s.55℃退火15s，72℃延伸30s共35个循环72%延伸5min.4℃保荐．
8.4等位基因检测
8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测8.4.1.1清洗玻璃板
将坡璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两避，干燥。在长板上涂上C.5ml亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻离板互机污染。8.4.1.2组装电泳板
待玻璃板彻底丁燥后组装电泳板.并用水平仪调平。8.4.1.3灌胶
NY/T 2474—2013
取60mI.5%的聚丙烯酰腰胶（极据不同号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方式）.300l过硫酸铵（APS)和6OμL四甲基乙二胺（TEMED)轻轻混勾，将胶缓缓的灌入。当胶到底部后将板放置水平,将梳子插人适当位置,并用夹子夹紧，以防点样谢瀚样。聚合2h以上而于电泳。过程中随止l现气泡。
8.4.1.4预电泳
将梳广小心拔出.用洗瓶清洗干净，然后擦十净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加人1×TBE。在恒功率70W条件下预电泳30min。8. 4. 1.5变性
在PCR产物中入36×加样缓冲液，混纠后,在PCR仪」运行变性程序℃变性5 i1.然后立即置于冰上冷都,使DNA保持单链状态。8.4.1.6电泳
预电泳结束后.将胶面的气泡及杂质吹打干净，将梳了轻轻插入，共深度为刚逆人胶面1mm，每一个加样孔点入5uI.样品。70W恒功率电泳至上部的指示到达胶板的中部。电泳结束后.小心分开两块坡璃板，凝胶会紧贴在长板上。8.4.1.7银染（快速银染法）
固定：固定液中轻轻晃动3min，需耍固定2次，第2次固定液回收待用；a
b）染色：染色液中染色12min；漂洗：水加硫代硫酸钠漂洗一次305.第2次用双蒸水快速漂洗，30s：d）显影:显影液中轻轻显动至带纹邸现；e）定影：用回收的固定液定影2min漂洗：双蒸水漂洗1min。
8.4.2DNA分析仪检测
8.4.2.1样品准备
首先根据不同的荧光基团将PCR产物稀释一定的倍数。一般6-FAM荧光基团PCR产物稀释8C倍,HFX、ROX、TAMRA荧光尘团PCR产物稀释30倍：然后分别取等体积的上述4种稀释启溶液混合.从混合液中吸取1.0uL加人到DNA分析仪专用深孔板孔中，板中各孔分别加人0.1100分子量内杯利8.9u去离子甲酰腰，除待测样册外。还应厕时包括标准样品的扩增产物。将样品在PCR仪十.95'C变性5mi，立即取出置丁碎冰上：冷却10min以上、凝时离心10s后上机电泳。8.4.2.2开机准备
打开DVA分析仪：检食仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶，将装有样品的微孔板置放了样品架基座上。打开数据收集软件，
8.4.2.3编辑电泳板
点L菜单中的\plate:nanagcr\按钮，然后在石侧窗口点出“New\按钮创建一个新的屯板，在\Name\和\lD\栏中输入电泳板的名称，在\application\选项中选\Gencnappcr-Gcnctic\，在\Platc\Iype\选项中选择\96-well\.在“owner\和\operator\项中分别输人板所有者和操作者的名字，点击\“OK\按钮，
8.4.2.4电泳
在Runscheduier\工具栏中，点击“Search\按钮，选中已编辑好的电泳板·点击样品板，电泳板利样品板关联.然后点工具条中左上角的绿色三角按钮·开始电泳。9等位基因数据采集
9.1数据格式
iiiKAoNhiKAca
NY/T 2474—2013
样品每个SSR位点的等位基内采用护增片段大小的形式表示。9.2变性聚丙烯凝胶电泳银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位置与对应的标推样品进行比较，与待测样品相同的标准样品的片般大小即为待测样品该引物位点的等位墨因扩增开段大小。9.3DN4分析仪检测
使用DNVA分析仪的片段分析软件：读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据，通过使用标准样品·消除同型号不同批次间或不同型号DVA分析仪间可能存在的系统误差，比较标准样品的等位基因扩增片段人小数据与表C.1中的数据。如两者不一致：其荒数邸是系统误差的大小。从待测样品的等位基因扩增片段数据中去除该系统误差、获得的数据即为待测样品的等位基因扩增片段大小。
10结果记录
纯合位点的等位基因扩增片段数据记录为XXX/XXX，其中XXX为该位点等位基因扩增片段大小；杂合位点的等位基因扩增片投数据记录为XXX/YYY，其中XXX，YYY分别为该位点E两个不同的等位基因.小片段数据在前，人片段数据在后；缺失位点的等位基因数据记录为0/0。示例1:
一个品种的一个SSR位点为纯合位点,等位基因扩增片段大小为12) bp则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/120。
示例2：
一个品种的一个SSR位点为杂台位点两个等位基因扩增片段大小分别为120 bp.126 bp,则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/126。11判定标准
品种鉴定包括对两个或两个以上的品种同时进行检测（\直接比较\）和对待测品种进行检测后利月其检测数据和数据库中品种的数据进行比对(“数据库比较”)两种情况。11.1直接比较
对待测品种和对照同时进行检\直接比较”)时，用附录（中核心引物检测，获得待测品种在这些引物位点的等位基因数据，利用这些数据进行品种间比较：）品种问差异位点数≥2.判定为不同品种：b）品种间差异位点数一1,判定为近似品种；℃）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种。对丁b)和c)的两种情况.应按照GB/T19557.1给出的原则进行田间测试.确定品种间在形态性状上是否存在明显差异。
11.2数据库比较
对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比较\)时，用附录C中核心引物检测·获得待测品种在上述引物位点的等位基因数据.利爪这些数据和数据库中品种进行比较：
a）品种问差异位点数2,判定为不同品种；h）品种间差异位点数一1.判定为近似品种；c）品种间差异位点数一0.判定为疑同品种，对于和心的两种情锐，将这些相近品种或疑品种与待测品种拨照11.1的方法进行整定，4
A.1仪器设备
A.1.1PCR扩增仪。
A.1.2电泳柳及配套的制胶附件。A.1.3高压电泳仪。
A.1.4水平摇床。
A. 1. 5 胶片观察灯。
，电子大平。
A.1.7微量移液器。
磁力搅拌器。
电磁炉。
微波炉。
高压火菌锅。
酸度计。
台式高速离心机。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
附录A
（规范性附录）
仪器设备及试剂
NY/T 2474—2013
5DNA分析仪：基于毛细管电泳，有 IDNA片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核甘酸的差异。
水浴锅或金属浴：控温精度土1℃。冰箱：最低温度一20℃！
紫外分光光度计。
A.2试剂
十八烷基三乙基溴化铵(CTAB)。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
A.2.3乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)。A.2. 4三羟巾基氨基凸烷(Tris 碱)A.2.5浓盐酸
A.2.6氢氨化钠(Na()H)。
A.2.710xBuner缓冲液（含 Mg)。A.2.8四种脱氧核苷酸：4XdNTP
A.2.9TalDNA聚合酶，
iiiKAoNiiKAca
NY/T2474—2013
去离子甲酰胺。
溴酚蓝。
甲苯青 FF，
甲叟双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
泉和殊烷：97%，
剥离硅烧：2%二甲基二氯硅烷。无水乙醇。
四印基乙二胺(TEMED)
过硫酸铵（APS）免费标准下载网bzxz
冰醋骏。
硝酸银。
甲醛。
氯仿。
异戊醇。
异丙醇。
DNA分析仪用分子量内标,LIZ-500分子量内标。DNA分析仪用丙烯酰胺胶液（PO)P-4胶）DNA分析仪用光谱校准基质，包括6-FAM、TAMRA、IIEX和ROX1种荧光标记的LDNATDNA分析仪专用电滤缓冲液。
B.1DNA提取溶液的配制
附录B
【规范性附录】
溶液配制
B.1. 1 0. 5mul/L乙二胺四乙酸二钠(FIYTA-Naz)pH=8.0)溶液NY/T2474—2013
称取186.1gEDTA-Nae溶于800mL燕馏水中,用体Na()H调μH至8.0,定容至1000ml高压灭菌。
B.1.21ml/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris~HCI)(pH=8. 0)溶液称取60.55gTris碱溶于适量水中，加IICI调pH至8.0.定容至500mL.,高压火菌，B. 1. 30. 5 mol/ L 盐酸(HICI)溶液取25mL浓盐酸（36%38%）.加水定容不500nl.cB.1.4DNA 提取液
称取CTAB20gNaCl81.816gPVP20g，量取1mol/LTris-HCI溶液(pH8.0)IC0mL.0.5mol/LEDrA溶液(pIl8.0)40mL,定容至1000mI-。B.1.55mol/L氯化钠(NaCI)溶液
称取146g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。B.1.6氯仿一异戊醇(24:1)
按24：1的比例(体积比)配制混合液。B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1dVTP
用超纯水分别配制A,GC、T终浓度100mt1o1/L的储存液。各取2CL泥合，用超纯水720μl定容至终浓度2.5 mmol/L的工作液。B. 2. 2SSR 引物
根据合成后引物浓度用超纯水分别配制止向引物和反向物终浓度均10u1o1/L的储存液，各取10uL混合：用超纯水80μl.定容至终液度10urnol/L的工作液。引物十粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液
称取溴蓝0.125g、甲举0.125g，量取去离酰胺19mL、0.5mo1/I.的EDTA溶液（pH8.0)] mL.
B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B. 3. 1 40%PAGE胶
称取丙烯酰胺190g和叉双内烯酰胺10g，定穿至0ml.。B. 3. 26. 0% PAGE胶
称取尿素420g，景取10×TBE缓冲液100ml..40%PAGE胶150mL，定容至1C00mlB.3.3亲和硅烷
量取49.75ml.无水乙醇和25Cul.冰醋酸，加水定容至50niL，7
iiKAoNiKAca
NY/T2474—2013
B.3.4亲和硅烷工作液
在1mBind缓冲液中加人5LBind原液，混匀。B. 3.5剥离硅烷工作液
2%甲基二氯硅烷，
B.3.610%过硫酸铵溶液
称取.1g过硫酸铵溶于1.ml.超纯水中，B. 3. 710 × TBE 缓冲液
称取Tris碱108g、硼酸55g,量取C.5mol/LE[>TA溶液37ml..定容至1000 ml.。B. 3. 81 × TBF 缓冲液
量取10×TBE缓冲液500ml加水定容至5000mLB.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取5ml.冰醋酸,100mL乙醇.加水定容至1Q00mL。B.4.2染色液
称取了g硝酸银，湘水定容至1000ml.B.4.3显影液
量取1000ml蒸馏水，加人10g氢氧化钠和2ml.甲醛。8
核心引物及套照品利见表℃1。
SSR00262
SSR16605
SSR10839
SSR05723
SSR17922
SSR03070
SSR05748
SSR23220 :
SSR20079
SSR10518
SSR04530
SSR07131.
SSR02771
SSR06210
SSR03820
魏色体
附录C
（规范性附录）
核心引物
核心引物及参照品种
引物序列（5°+3\）
F:GGTTGGIGI'GGAGTGTGA
R: TGTAAAAGTGATCAGGAGGTC
F,CACAAICCCACGAAGAACAA
R, TGCAATIAIGGCAAATCAAAA
F:TIGAATTCCTCTGCCCAATC
R, TGGAATTTTGITAGGGGGAA
F:TGGCTTITCTGTCACGTCC
R:TCCATGGTACAACAAGAATCACA
F:CATTCTAGGTCAATGAATTGCA
R;GCAAAGTTGCCACATTGAAG
F: GCTAACACTACTOGCTGGTT
R,AACAGAAAGAGAATCGGGGG
F: TGTGGCCTGTGOTAAAATGA
: R:TTTGGAAAAGCTAAAGECCA
F:GTTTGCATGAAAATGGGGAT
R:CATCATCTTCTTGGTGGTTCC
F.ATCAGCATGTTGTGTGGTGT
R:GGGATATGCGTTTGCATTTA
F:TCTAATTCGGTCCGGATGAT
R, ITGCAGCGAACAATCTGTA
F :CCTCTAGACTGAAAAAGAGGGACA
: R:ATTATTTGGGCCTTTGGGAA
F: TTCTCATGCTTCCTACCGGT
R:TTCTATTGGAGGGCIGGTTG
F: AAGTACACLAGCATTGGG
R:CACACTUIIATGGTIICICA
F: TTGGAAAAGTCGCCAAACTT
R : TCCATGTCTGCTTTTGA TTCC!
F: AGAGGGCAAATTGGTGAATG
R: T(XATCCTGTATGATTTGAGTI
荧光染料
5'6 - FAM
5\HIEX
5'G-FAM
5'TAMRA
s'G-FAM
5'TAMRA
5'TAMRA
5'TAMRA
TiiKAoNiiKAca
NY/T2474—2013
参照品种
中农15号
津所4寻
中农29号
津码·子
早元2号
中农8号
农9号
中农19号
绿衣天使
鲁黄瓜8号
长春密刺
北点小刺
津础号
中农19号
津砭4号
中农19号
津美2号
北京小刺
长春密剌
津研）号
津研：号
中农6号
中农19号
中农12号
限20号
帅农15号
限12号
中农19号
菏泽线瓜
津研4号
中农9号
卷华1号
弃黄瓜乡号
皆杂16号
鲁蔬531
津研号
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中华人民共和国农业行业标准
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黄瓜品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol for the identification of cucunber varieties-SsR marker method
2013~12-13 发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
范围·
规范性引用文件
3术语和定义
原理．
仪器设备及试剂
试剂和溶液配制
操作程序
等位基因数据采集
结果记录
判定标准
附录A（规范附录）
附录B(规范性附录)
附录（(规范性附录）
附录 D(资料性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制
核心引物
参照品种
NY/T 2474—2013
NY/T2474—2013
本标推按照GB/T1.1--20C9给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本义件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标雄由农业部种子管理局提：本标准出全国植物新品和测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归IF。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花产征究所.农业部科技发展中心本标雅主要起草人：苗晗、张圣平、顾兴芳、王烨、莫青。1范围
黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T 2474—2013
本标准规定了利历简单重复序列（SimpleSequerceRepeals.SSR）分子标记进行黄瓜（CucumissaiuusI.)品种鉴定的试验方法、数据记录格式及判定标准。本标准适用丁黄瓜DNA分了数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文作的应用是必不川少的。凡是注且期的引用文件，仅注口期的版本适用十本义件。凡足不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程GB/T19557.1植物新品种特异性、-敛性和稳定性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物Core Primers
核心引物指分布于黄瓜每条染色体工·多态性、稳定性、重复性等综合特性好、作为『NA指纹鉴定优先选用的一套引物。
参照品种Referenctvariety
参照品种指对应于SSR位点不同等位基因的--维品种。参照品种用丁确定待测样品在某个SSR位点上等位基因扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。4．原理
简单重复序列（SSR)）分布十黄瓜整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数日及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守和单拷贝的.闪而可根据其两端的序列设计-·对特异引物，利历PCR技术对重复序列进行扩增，在电泳过程中：PCR产物在电场作门下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分，根据FCR产物的带型差异鉴定黄瓜品种。
5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂名单见附录A，
6试剂和溶液配制
相关溶液配制方法见附录B。
7引物
核心引物名单见附录C。
-iiKAoNhiKAca
NY/T 2474—2013
8操作程序
8.1样品准备
8.1.1对于种子样品的分样和保存，按CB/T3513.2的规定进行。8.1.2每份样品至少检测5个个体，每个个体单独分析。对一致性差的样品应增加检测个休至10个以上.每个个体单独分析。
8.2DNA提取
提供两种DNA提取方法
方法一：选胶植株下胚轴或幼叶30m~40m%置十2.0tmL离心管中，用液氮研磨至粉状：加入700μL2%CTAB预热缓冲液，65℃水浴1h，加人700匙氯伤一异成醇（24：1），下混勾10min，16200g离心10min；吸取上清液加人预先装有70GuL异内醇的1.5ml的离心管巾.上下混匀后放一20℃冰箱30min.16200g离心1Gmir1；弃上清，经70%乙醇洗涤后加人100L超纯水：待充分溶解后备用，适用计露要大量提敢DNA和长期贮荐的情况。方法：选取植株下胚轴或幼叫30ng~4011g置于2.0mL离心管中：而液氮研磨.食粉状.加3JoL0.1mol/LNa)II,沸水加热10rnin.加入等体积超纯水，直接取2.0uL进行SSR扩增，于4℃保存。适用丁高通量快速提取DVA，但DVA浓度较低H不适十长期购存。注：以上为推荐的两种DNA提取方法，所获DVA质量能够符合FCR扩增需要的LINA提取力法都适用于本标谁
8.3PCR扩增
8.3.1标准样品的使用
在进行PCR扩增和等位基因检测时，应同时包括相应的标准样品，不同位点的标准样品的名称见录C。某一位点上具有相同的等位基网的标准样品可能不止，个，在确认这些样品在某一位点上的等位基因人小后，性可将这些样品代替附录心中的标准样品。对于附录（中术包括的等位基因：应按本标准的方法，通过使用DNA分析仪与标准样品同时进行检测确定其大小。同一名称不同来源的标准样品在某一位点上的等位基因可能不相尚，在使用前应与原标准样品进行核对，
注：多个品种在某一位点上可能都具存相同的等位基因，在砸认这些品种某一位点上等位基因大小后,这些品种也可以代誉谢录（的标准样品使，8.3.2反应体系
SSR反应休系，包括基组DNA20.0ng，1×Bufer缓冲液（含Mg2）,dNTP2.5mmol/L，正反向引物各30 ng.Tag 0.5U,其余以超纯水补足。推荐使用15 μuL~-20μL反应体积8.3.3反应程序
94%预变性4min.94℃变性15s.55℃退火15s，72℃延伸30s共35个循环72%延伸5min.4℃保荐．
8.4等位基因检测
8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测8.4.1.1清洗玻璃板
将坡璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两避，干燥。在长板上涂上C.5ml亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻离板互机污染。8.4.1.2组装电泳板
待玻璃板彻底丁燥后组装电泳板.并用水平仪调平。8.4.1.3灌胶
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取60mI.5%的聚丙烯酰腰胶（极据不同号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方式）.300l过硫酸铵（APS)和6OμL四甲基乙二胺（TEMED)轻轻混勾，将胶缓缓的灌入。当胶到底部后将板放置水平,将梳子插人适当位置,并用夹子夹紧，以防点样谢瀚样。聚合2h以上而于电泳。过程中随止l现气泡。
8.4.1.4预电泳
将梳广小心拔出.用洗瓶清洗干净，然后擦十净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加人1×TBE。在恒功率70W条件下预电泳30min。8. 4. 1.5变性
在PCR产物中入36×加样缓冲液，混纠后,在PCR仪」运行变性程序℃变性5 i1.然后立即置于冰上冷都,使DNA保持单链状态。8.4.1.6电泳
预电泳结束后.将胶面的气泡及杂质吹打干净，将梳了轻轻插入，共深度为刚逆人胶面1mm，每一个加样孔点入5uI.样品。70W恒功率电泳至上部的指示到达胶板的中部。电泳结束后.小心分开两块坡璃板，凝胶会紧贴在长板上。8.4.1.7银染（快速银染法）
固定：固定液中轻轻晃动3min，需耍固定2次，第2次固定液回收待用；a
b）染色：染色液中染色12min；漂洗：水加硫代硫酸钠漂洗一次305.第2次用双蒸水快速漂洗，30s：d）显影:显影液中轻轻显动至带纹邸现；e）定影：用回收的固定液定影2min漂洗：双蒸水漂洗1min。
8.4.2DNA分析仪检测
8.4.2.1样品准备
首先根据不同的荧光基团将PCR产物稀释一定的倍数。一般6-FAM荧光基团PCR产物稀释8C倍,HFX、ROX、TAMRA荧光尘团PCR产物稀释30倍：然后分别取等体积的上述4种稀释启溶液混合.从混合液中吸取1.0uL加人到DNA分析仪专用深孔板孔中，板中各孔分别加人0.1100分子量内杯利8.9u去离子甲酰腰，除待测样册外。还应厕时包括标准样品的扩增产物。将样品在PCR仪十.95'C变性5mi，立即取出置丁碎冰上：冷却10min以上、凝时离心10s后上机电泳。8.4.2.2开机准备
打开DVA分析仪：检食仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶，将装有样品的微孔板置放了样品架基座上。打开数据收集软件，
8.4.2.3编辑电泳板
点L菜单中的\plate:nanagcr\按钮，然后在石侧窗口点出“New\按钮创建一个新的屯板，在\Name\和\lD\栏中输入电泳板的名称，在\application\选项中选\Gencnappcr-Gcnctic\，在\Platc\Iype\选项中选择\96-well\.在“owner\和\operator\项中分别输人板所有者和操作者的名字，点击\“OK\按钮，
8.4.2.4电泳
在Runscheduier\工具栏中，点击“Search\按钮，选中已编辑好的电泳板·点击样品板，电泳板利样品板关联.然后点工具条中左上角的绿色三角按钮·开始电泳。9等位基因数据采集
9.1数据格式
iiiKAoNhiKAca
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样品每个SSR位点的等位基内采用护增片段大小的形式表示。9.2变性聚丙烯凝胶电泳银染检测将待测样品扩增片段的带型和泳动位置与对应的标推样品进行比较，与待测样品相同的标准样品的片般大小即为待测样品该引物位点的等位墨因扩增开段大小。9.3DN4分析仪检测
使用DNVA分析仪的片段分析软件：读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据，通过使用标准样品·消除同型号不同批次间或不同型号DVA分析仪间可能存在的系统误差，比较标准样品的等位基因扩增片段人小数据与表C.1中的数据。如两者不一致：其荒数邸是系统误差的大小。从待测样品的等位基因扩增片段数据中去除该系统误差、获得的数据即为待测样品的等位基因扩增片段大小。
10结果记录
纯合位点的等位基因扩增片段数据记录为XXX/XXX，其中XXX为该位点等位基因扩增片段大小；杂合位点的等位基因扩增片投数据记录为XXX/YYY，其中XXX，YYY分别为该位点E两个不同的等位基因.小片段数据在前，人片段数据在后；缺失位点的等位基因数据记录为0/0。示例1:
一个品种的一个SSR位点为纯合位点,等位基因扩增片段大小为12) bp则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/120。
示例2：
一个品种的一个SSR位点为杂台位点两个等位基因扩增片段大小分别为120 bp.126 bp,则该品种在该位点上的等位基因扩增片段数据记录为120/126。11判定标准
品种鉴定包括对两个或两个以上的品种同时进行检测（\直接比较\）和对待测品种进行检测后利月其检测数据和数据库中品种的数据进行比对(“数据库比较”)两种情况。11.1直接比较
对待测品种和对照同时进行检\直接比较”)时，用附录（中核心引物检测，获得待测品种在这些引物位点的等位基因数据，利用这些数据进行品种间比较：）品种问差异位点数≥2.判定为不同品种：b）品种间差异位点数一1,判定为近似品种；℃）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种。对丁b)和c)的两种情况.应按照GB/T19557.1给出的原则进行田间测试.确定品种间在形态性状上是否存在明显差异。
11.2数据库比较
对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比较\)时，用附录C中核心引物检测·获得待测品种在上述引物位点的等位基因数据.利爪这些数据和数据库中品种进行比较：
a）品种问差异位点数2,判定为不同品种；h）品种间差异位点数一1.判定为近似品种；c）品种间差异位点数一0.判定为疑同品种，对于和心的两种情锐，将这些相近品种或疑品种与待测品种拨照11.1的方法进行整定，4
A.1仪器设备
A.1.1PCR扩增仪。
A.1.2电泳柳及配套的制胶附件。A.1.3高压电泳仪。
A.1.4水平摇床。
A. 1. 5 胶片观察灯。
，电子大平。
A.1.7微量移液器。
磁力搅拌器。
电磁炉。
微波炉。
高压火菌锅。
酸度计。
台式高速离心机。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
附录A
（规范性附录）
仪器设备及试剂
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5DNA分析仪：基于毛细管电泳，有 IDNA片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核甘酸的差异。
水浴锅或金属浴：控温精度土1℃。冰箱：最低温度一20℃！
紫外分光光度计。
A.2试剂
十八烷基三乙基溴化铵(CTAB)。A.2.2聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
A.2.3乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)。A.2. 4三羟巾基氨基凸烷(Tris 碱)A.2.5浓盐酸
A.2.6氢氨化钠(Na()H)。
A.2.710xBuner缓冲液（含 Mg)。A.2.8四种脱氧核苷酸：4XdNTP
A.2.9TalDNA聚合酶，
iiiKAoNiiKAca
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去离子甲酰胺。
溴酚蓝。
甲苯青 FF，
甲叟双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿素。
泉和殊烷：97%，
剥离硅烧：2%二甲基二氯硅烷。无水乙醇。
四印基乙二胺(TEMED)
过硫酸铵（APS）免费标准下载网bzxz
冰醋骏。
硝酸银。
甲醛。
氯仿。
异戊醇。
异丙醇。
DNA分析仪用分子量内标,LIZ-500分子量内标。DNA分析仪用丙烯酰胺胶液（PO)P-4胶）DNA分析仪用光谱校准基质，包括6-FAM、TAMRA、IIEX和ROX1种荧光标记的LDNATDNA分析仪专用电滤缓冲液。
B.1DNA提取溶液的配制
附录B
【规范性附录】
溶液配制
B.1. 1 0. 5mul/L乙二胺四乙酸二钠(FIYTA-Naz)pH=8.0)溶液NY/T2474—2013
称取186.1gEDTA-Nae溶于800mL燕馏水中,用体Na()H调μH至8.0,定容至1000ml高压灭菌。
B.1.21ml/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris~HCI)(pH=8. 0)溶液称取60.55gTris碱溶于适量水中，加IICI调pH至8.0.定容至500mL.,高压火菌，B. 1. 30. 5 mol/ L 盐酸(HICI)溶液取25mL浓盐酸（36%38%）.加水定容不500nl.cB.1.4DNA 提取液
称取CTAB20gNaCl81.816gPVP20g，量取1mol/LTris-HCI溶液(pH8.0)IC0mL.0.5mol/LEDrA溶液(pIl8.0)40mL,定容至1000mI-。B.1.55mol/L氯化钠(NaCI)溶液
称取146g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。B.1.6氯仿一异戊醇(24:1)
按24：1的比例(体积比)配制混合液。B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1dVTP
用超纯水分别配制A,GC、T终浓度100mt1o1/L的储存液。各取2CL泥合，用超纯水720μl定容至终浓度2.5 mmol/L的工作液。B. 2. 2SSR 引物
根据合成后引物浓度用超纯水分别配制止向引物和反向物终浓度均10u1o1/L的储存液，各取10uL混合：用超纯水80μl.定容至终液度10urnol/L的工作液。引物十粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液
称取溴蓝0.125g、甲举0.125g，量取去离酰胺19mL、0.5mo1/I.的EDTA溶液（pH8.0)] mL.
B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B. 3. 1 40%PAGE胶
称取丙烯酰胺190g和叉双内烯酰胺10g，定穿至0ml.。B. 3. 26. 0% PAGE胶
称取尿素420g，景取10×TBE缓冲液100ml..40%PAGE胶150mL，定容至1C00mlB.3.3亲和硅烷
量取49.75ml.无水乙醇和25Cul.冰醋酸，加水定容至50niL，7
iiKAoNiKAca
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B.3.4亲和硅烷工作液
在1mBind缓冲液中加人5LBind原液，混匀。B. 3.5剥离硅烷工作液
2%甲基二氯硅烷，
B.3.610%过硫酸铵溶液
称取.1g过硫酸铵溶于1.ml.超纯水中，B. 3. 710 × TBE 缓冲液
称取Tris碱108g、硼酸55g,量取C.5mol/LE[>TA溶液37ml..定容至1000 ml.。B. 3. 81 × TBF 缓冲液
量取10×TBE缓冲液500ml加水定容至5000mLB.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取5ml.冰醋酸,100mL乙醇.加水定容至1Q00mL。B.4.2染色液
称取了g硝酸银，湘水定容至1000ml.B.4.3显影液
量取1000ml蒸馏水，加人10g氢氧化钠和2ml.甲醛。8
核心引物及套照品利见表℃1。
SSR00262
SSR16605
SSR10839
SSR05723
SSR17922
SSR03070
SSR05748
SSR23220 :
SSR20079
SSR10518
SSR04530
SSR07131.
SSR02771
SSR06210
SSR03820
魏色体
附录C
（规范性附录）
核心引物
核心引物及参照品种
引物序列（5°+3\）
F:GGTTGGIGI'GGAGTGTGA
R: TGTAAAAGTGATCAGGAGGTC
F,CACAAICCCACGAAGAACAA
R, TGCAATIAIGGCAAATCAAAA
F:TIGAATTCCTCTGCCCAATC
R, TGGAATTTTGITAGGGGGAA
F:TGGCTTITCTGTCACGTCC
R:TCCATGGTACAACAAGAATCACA
F:CATTCTAGGTCAATGAATTGCA
R;GCAAAGTTGCCACATTGAAG
F: GCTAACACTACTOGCTGGTT
R,AACAGAAAGAGAATCGGGGG
F: TGTGGCCTGTGOTAAAATGA
: R:TTTGGAAAAGCTAAAGECCA
F:GTTTGCATGAAAATGGGGAT
R:CATCATCTTCTTGGTGGTTCC
F.ATCAGCATGTTGTGTGGTGT
R:GGGATATGCGTTTGCATTTA
F:TCTAATTCGGTCCGGATGAT
R, ITGCAGCGAACAATCTGTA
F :CCTCTAGACTGAAAAAGAGGGACA
: R:ATTATTTGGGCCTTTGGGAA
F: TTCTCATGCTTCCTACCGGT
R:TTCTATTGGAGGGCIGGTTG
F: AAGTACACLAGCATTGGG
R:CACACTUIIATGGTIICICA
F: TTGGAAAAGTCGCCAAACTT
R : TCCATGTCTGCTTTTGA TTCC!
F: AGAGGGCAAATTGGTGAATG
R: T(XATCCTGTATGATTTGAGTI
荧光染料
5'6 - FAM
5\HIEX
5'G-FAM
5'TAMRA
s'G-FAM
5'TAMRA
5'TAMRA
5'TAMRA
TiiKAoNiiKAca
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参照品种
中农15号
津所4寻
中农29号
津码·子
早元2号
中农8号
农9号
中农19号
绿衣天使
鲁黄瓜8号
长春密刺
北点小刺
津础号
中农19号
津砭4号
中农19号
津美2号
北京小刺
长春密剌
津研）号
津研：号
中农6号
中农19号
中农12号
限20号
帅农15号
限12号
中农19号
菏泽线瓜
津研4号
中农9号
卷华1号
弃黄瓜乡号
皆杂16号
鲁蔬531
津研号
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