NY/T 2476-2013
基本信息
标准号： NY/T 2476-2013
中文名称：大白菜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
NY/T 2476-2013 大白菜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2476-2013
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标准内容
ICS 67.080.20
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2476—2013
大自菜品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identificafion of heading Chinese cabbage varietiesSSR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
规范性引用文件.
术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
参照品种及其使用
操作程序
10等位变异数据采集
11判定标准·
附录A（规范性附录）
附录B(规范性附录）)
附录C（规范性附录)
附录 D(资料性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制·
核心引物
参照品种名单
NY/T 2476—2013
NY/T 2476—2013
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任。本标雅由农业部种了管理局提出。本标准中全国植物新品种测试标准化技术委员会(SA(/IC277)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业部科技发展中心。木标准主要越草人：李汝玉、张晗、十东建、张新明、郑永胜、孙加梅、宋国安、姚风霞、许金旁、段丽丽、李华、上湾梅。
1范围
NY/T2476—2013
大白菜品种鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定了利用简单再复序列(Simplesuuuenirereprats，SsR)标记进行大自案[Bruxsira rapuL.ssp.Peeinensis(Lour.)(lssonl品种鉴定的试验方法、数据证录格式和判定标准本标准适用十大案SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡尼不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。CB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物core primen
多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3.2
参照品种reterence variety
对应于SSR位点上不同等位变异的组品种。参照品种用十辅助确定待测样品等位变异的大小。校正仪器设备的系统误差。
4原理
SSR广泛分布于人白菜基闷组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。出丁每个SSR位点两侧的予列--般是高度保守和单拷贝的.因而可根据其两侧的序列设计，对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的INA序则进行扩增，在电泳过程中，主要出于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性.利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大白菜品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录B。
7引物
引物相关信息见附录（
8参照品种及其使用
参照品种的名称见附录C.参照品种名单参见附录D1
iiKAoNiKAca
NY/T24762013
在进行等位变异检测时，应同时包括相应容照品种。注1:多个品种在某5S尺位点上川能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录C中的参照品种使用。注2：同一名称不同米源的参照品种的某·一位点上的等位变可能不相同：在使其来源的参照品种时，应与原参熊品种核对，确认无误后用，
注3：对于附录（小未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应参照品种，9操作程序
9.1重复设置
设置2次生物学重复。
9.2样品准备
种子样品的钎样、分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。每个品种分取2个样品，每个样品30个个体（种子、叶片或其他器官组织），等量混合。9. 3 INA 提取
采用CTAB法：取动嫩组织混合样0.2g，放人1.5mI.离心管中，在液氮中研碎；或将种子研碎，放人1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加人400μl，混匀样品。将离心管置于65%金属浴或水裕锅中，保温30min后取下。向离心管中加人400μL24：1氯仿一异戊醇（V：V），振荡混匀。10000离心10min。将上清液200uL转人另一只1.5mL离心管，加人400μl，20%预冷无水乙醇沉淀DNA，10000g离心］min，弃上滑液.加入500μl.乙醇-乙酸铵溶液.6000g离心5min收集沉淀，加入100μLTE(pH8.0)溶液溶解DVA，检测DNA浓度。20%保存。注：其他所获IINA质盘能够满足PCR扩消需要的NA提取方法都适用于本标准，9.4ICR扩增
9.4.1反应体系
25μL的反应体,含每种dVIP0.25mtol/L,正向引物、反向引物各0.4μmoi/I.,IagDNA聚合酶1.0U.1×PCR缓冲液(不含Mg*+）,MgCl1.5mmol/L,样品DNAJ0-40ng，利用毛细管电泳荧光检测时使荧光标记的引物。引物的光染料种类附录C注：反应体系你体积可以根据具体情况进行调整。9.4.2反应程序
94%预变性4min；94℃变性45，65℃退火45s，72℃延伸158，每循坏降1℃，共15个循环；94℃变性45，50℃退火30s，72%延伸45s，共30个循环；72%延伸10min，4℃保存9.5PCR产物检测
9.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.5.1.1清洗玻璃板Www.bzxZ.net
将坡璃板清洗十净，用去离子水冲洗后晾下。用无水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦下，在长板上涂上0.5ml.亲和硅烷工作液，带叫槽的短板上涂0.51mL剥离裤烷T作液。操竹过程防止两块玻璃板互相污染。
9.5.1.2组装玻璃板
玻璃板彻底十燥后，将其纠装成电泳胶板，用水平仪调平。垫片厚度为0.4mm。9. 5. 1. 3制胶
在100ml.6.0%PAGE胶中分别加人TEMED50，L和新配制的10%过硫酸铵溶液500uL，迅速混勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻入胶液约0.4cm。灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合全少1h以上，胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拨出2
梳子，门水清洗十净各用、
9.5.1.4预电泳
NY/T2476—2013
将胶板安装于电泳树上：.商.1:槽中加人约800mL预热举65℃的0.25×TBE缓冲液，便其超过凝胶顶部3cm，向下中加人800m，1×I3F缓冲液。在60W恒功率下，预电泳10min20nain。9.5.1.5样品制备
在25LPCR样品巾加入10uI.上样缓冲液，混匀，在水锅或PCR仪1：95℃变性5min，取出迅速暨于碎冰上。
9.5.1.6电泳
用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡聚丙烯酰胺碎片。将鲨色齿梳广梳齿端凝胶1mn～2n。每-个加样孔点人2ul-~3uL样品。除得测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物，在50W~80W恒功率下电泳，使凝胶涩度保持在约50℃。电泳1.5h~2.5h(电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝咬附着的长玻璃极准备固定。注：具体功察大小根据电泳槽的规格型号和实验空室溢设定。9.5.1.7银染
固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加人约1000ml银染固定液，使固定液没过凝a
胶，在摇床上轻轻显动 20 min~-30 min;漂洗：取山玻璃板，在县离子水中漂1次～2次，每次2ni6
染色：将玻璃板置放人约1000mL染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻异动30min；c
漂洗：在去离子水中快速漂洗·时间不超过10$d)
显影：将玻璃板在预冷的显影液中轻轻晃动至1现清晰带纹：定影：将凝胶在固定液中定影5min;漂洗：在太离子水中漂洗1min。9.5.2毛细管电泳荧光检测
9.5.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和R(X荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1μl..17.50分子量内标和8.9μL去离子甲胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DVA分析假上。
除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括2个~3个参照品种的扩增产物。注：不同炭光标记的扩增产物的最适稀释音数最好道过泛纤臂电泳荧光检测顽试验确定。9.5.2.2开机准备
打开DNA分析仪、检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
9.5.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入忆泳板名称，选摔适合的程序和电泳板炎型，翰人样品编号或名称。
9.5.2.4运行程序
DNA分析仪自动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器巾。10等位变异数据采集
10.1数据表示
-iiiKAoNhiKAca
NY/T 2476—2013
样品每个SSR位点的等位变异采扩增片段大小的形式表示。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位宵进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异人小。10.3毛细管电泳荧光检测
使TNA分析仪的片段分析软件，读山每个位点每个样品的等位变异大小数据。比较参照品种的等位变并人小数据与附录C中参照品种相成的数据两者之问的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变分大小。示例1：参照品种\w3”\W13-8\在cnu_ml39a位点.上的等位变异大小分别为155bp和159bp.附录（比l“w3\\W13-8\相应的数据分别为157bp和161bp系统误差为2hp。个待测样品的等位变异人小原始数据为157lp则待测样品在该位点上的等位变异数据应为159 bp。示例2:参照品利\W3”\W138”在cnu_m016a位点上的等位变异大小为85hp和173b.附求（中r\W3\、\W:3·8\相应的数据分别为185bp和173bp+系统误差为0hp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为183bp.则待测样品在该位点上的等位变异数据应为183bp.10.4结果记录
纯合位点的等位变异记录为X/X.杂合位点的等位变异记录为X/Y。其中X,Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0。示例1：一个品种在cnu_m139a位点上有」个等位变异，人小为157bp.谢该品种在该位点t.的等位变异数据记录为157/157
示例2：一个品种在cnl_m016a位点上有2个等位变异，大小分别为183b.187bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为183/187。
10.5数据处理
一个位点2次重复检测数据相同时，该数据即为该位点的等位变异数据。2次蛋复不一致时.增加第三个重复，以其中2个重复相向的检测数据为该位点的等位变异数据。当3次重复结果都不相同时，该位点视为无效位点。
11判定标准
依据30对引物的检测结果进行判定：a）品种间差异位点数23,判定为不同品种；b）品种间差异位点数<3,判定为近似品种，A.1主要仪器设备
A. 1. 1 PCR 扩增仪。
A.1.2高压电泳仪。
A.1.3电泳槽及配查的制胶附件。A.1.4水·平电泳槽及配套的制胶附件。附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
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A.1.5DNA分析仪：基丁毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件.能够分辨最少1个核凸酸的差异。
A.1.6高速离心机。
A.1.7水平摇床。
A.1.8胶片观察灯。
A.1.9 电了天半。
A.1.10微量移液器。
A.1.11紫外分光光度计。
高压灭菌锅。
酸度评。
水浴锅或金属浴。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。A.2.1十六烷基二乙基溴化铵,
聚乙烯吡咯烷酮。
二氯甲烷，
A.2.4异醇。
A.2.5乙‘胺四乙酸二钠。
三羟时基氨基甲烷。
A.2.7浓盐酸、
A.2.8氨氧化钠。
A.2. 9Tag DNA 聚合酶
A. 2. 10 10×PCR缓冲液。
A.2.11氯化镁。
iiKAoNiiKAca
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氯化钠。
4种脱氧核糖核者酸。
SSR引物。
矿物油。
琼脂糖。
核酸染色剂。
太离子酰胺。
溴酚蓝。
三甲苯青。
甲义双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿索。
亲和硅烷。
剥离硅烷。
无水乙醇。
四甲基乙二胺，
过硫酸铵。
冰醋酸。
乙酸铵，
硝酸银。
DNA分析仪用聚丙烯酰胺胶液。
DNA分析仪用分子量内标：最人分子量500bp，Liz标记。A.2.35
6DNA分析仪用光谱校准基质：包括G-FAM、TAMRA、HEX利ROX4种荧光染料标记的A.2.36
DNA片段。
A.2.37DNA分析仪用电泳缓冲液。6
B.1DNA提取溶液的配制
B.1.11mol/L氢氧化钠溶液
附录B
[规范性附录]
溶液配制
NY/T2476—2013
称取40.0g氢氧化钠，溶丁800mL去离了水中.冷却全室温，定容至1000mL。B.1.20.5mol/L盐酸溶液
量取25ml36%～38%浓盐酸.加去离子水定容至500mL，B. 1. 3 0. 5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐tpII 8. 0)溶液称取186.1k乙二胺四乙酸二钠盐，加入800mL去离了水，加人20g氢氧化钠.搅拌。待乙二胺四乙酸钠盐完余溶解后，冷却至室温。再用氧氧化钠溶液（I.1.1)准碗调pTI至8.0，定容至1000ml。在103.4kPat121℃)条件下火菌20min。B. 1. 41 D1ol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸[pH1 8. 0]溶液称取60.55g二羟甲基氨基甲烷，溶于4001rL去离子水中,用献酸溶液(13.1.2)调pII至8.0.定容至500ml，在103.4kPa(121℃)条件下火菌20ninB. 1.5 DNA 提取液
分别称取20.心g十六烷基乙基化铵和81.82g氯化钠，分别加入40ml.乙二胺四乙酸钠盐溶液(pH8.0)(B.1.3)、100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0)(I.1.4)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加人800mL去离子水.65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa(121c）条件下灭菌20min。于4保存，B.1.6三氯甲烷一异戊醇混合液
V(三氯甲烷）：V(异戊醇)=24：1B.1.7乙醇-乙酸铵溶液
称取154.6mg乙酸铵,加人140mL无水乙醇,用么离子水睿至200mLB.1.8TE缓冲液
分别量取5 1nL羟甲基氨基甲烷酸溶液(pH8.0)(B. 1. 4)和i1ml.乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)(B.1.3),定容至500mL,在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃F保存。B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1 dNTP 溶液
用超纯水分别配制dATP、dTTP、dGTP和dTP4种脱氧核糖核苷酸终浓度为100mmol/L的储存液。分别量取4种储存液20μL混合，用120μl.超纯水定容，配制成每种核苷酸终浓度为10mmnl/1的.作液，在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min，于一20℃保存，注：也可使用满足试验要求的商品dNTP溶液。B.2.2SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为5umol/I.的工作液。B.2.3氯化镁溶液
-iiKAoNiiKAca
NY/T2476—2013
称取1.190g氯化镁，用离子水溶解定容至500mL，配制成25mmol/1.的工作液。在103.4kPa(121℃）条件\下灭菌20 min，一20℃保存。注；也可使用满足试验要求的商品熟化镁溶液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3. 110× TBE缓冲液
分别称取108.0g三羟甲基氢基甲烷和55.0g硼酸，济于800ml.去离子水.加人37mL乙一胺四乙酸二钠盐溶液（pl18.0)（B.1.3).定容至1000ml。B.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取190.0内烯酰胺和10.0g甲义双丙烯酰胺，溶于400ml去离子水中.定容至500mLB.3.36%变性聚丙烯酰胺胶溶液
称取420.0g尿素，用去离子水辫解，分别加入100ml.10×TBE缓冲液（B3.1)和150tmL40%内烯酰胺溶液（B.3.2)，定容至1000ml。B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75mL无水乙醇和250μl.冰醋酸，用去离子水定容至50mL，B.3.5亲和硅烷工作液
分别量取5μL亲和硅烧和1ml。亲和硅烷缓冲波，混勾。B.3.6剥离硅烷工作液
分别量取98ml.三氯甲烷游液和2ml.二甲基二氮硅烷浒液，混匀。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取1.0g过硫酸铵，济于10ml.去离子水中，混勾。于一4℃保存。B. 3. 81 ×TBE 缓冲液
量取500mL10×TBF缓冲液（B.3.1)，用去离了水定容至5000mL。B. 3. 96×加样缓冲液
分别称取0.25g溴酚蓝和0.25g二苯青，分别加入98mL去离了甲酰胺和1ml.乙一胺四乙酸二钠盐溶液（pJI8.0），搅拌溶解。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100ml.冰酷酸，加人1000ml去离了水。B.4.2染色液
称取1.0g硝酸，溶于1000ml.去离子水。B.4.3显影液
称取10g氢鐵化钠，溶丁100nmL去离子水巾，再加人5ml甲醛，8
核心引物表（.1。
连锁群
cnu_ml39a
ua_m086a
nia_m098a
nia_ml38a
cnlmM6#
附录C
【规范性附录】
核心引物
表 C. 1 核心引物
引物序列(5'-3'）
F: FCAAGKGCAAAAACATTGG
R: TGGFGTTAGGGTTTAAGGTTGTGG
FAGTICCTICICCAOXTTGT
R:TGCTIGTGGTCAATCTCTCA
F:GAGTUCAGTCAALAGAAGCA
R TCTXACTTCACAACAGAA
F:GTTTTAAATGXGIIG
R:GGGATCAAGAGATGTGGGA
F:GCTAAAGGTTTAGTCCAAATAGGATIY:R:GCAAAATGATGXCCCATAAA
S'TAMRA
S'TAMRA
iiKAoNiiKAca
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话266
参照品种
金贝2
福尔青
中白83
绿垦大棵菜
黄心娃
精选中
精逆中自81
北京大心
金贝-2
津绿3
西388~1
267：-
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术语和定义
仪器设备及试剂
溶液配制
参照品种及其使用
操作程序
10等位变异数据采集
11判定标准·
附录A（规范性附录）
附录B(规范性附录）)
附录C（规范性附录)
附录 D(资料性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制·
核心引物
参照品种名单
NY/T 2476—2013
NY/T 2476—2013
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任。本标雅由农业部种了管理局提出。本标准中全国植物新品种测试标准化技术委员会(SA(/IC277)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业部科技发展中心。木标准主要越草人：李汝玉、张晗、十东建、张新明、郑永胜、孙加梅、宋国安、姚风霞、许金旁、段丽丽、李华、上湾梅。
1范围
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大白菜品种鉴定技术规程SSR分子标记法本标准规定了利用简单再复序列(Simplesuuuenirereprats，SsR)标记进行大自案[Bruxsira rapuL.ssp.Peeinensis(Lour.)(lssonl品种鉴定的试验方法、数据证录格式和判定标准本标准适用十大案SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡尼不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。CB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物core primen
多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3.2
参照品种reterence variety
对应于SSR位点上不同等位变异的组品种。参照品种用十辅助确定待测样品等位变异的大小。校正仪器设备的系统误差。
4原理
SSR广泛分布于人白菜基闷组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。出丁每个SSR位点两侧的予列--般是高度保守和单拷贝的.因而可根据其两侧的序列设计，对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的INA序则进行扩增，在电泳过程中，主要出于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性.利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大白菜品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录B。
7引物
引物相关信息见附录（
8参照品种及其使用
参照品种的名称见附录C.参照品种名单参见附录D1
iiKAoNiKAca
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在进行等位变异检测时，应同时包括相应容照品种。注1:多个品种在某5S尺位点上川能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录C中的参照品种使用。注2：同一名称不同米源的参照品种的某·一位点上的等位变可能不相同：在使其来源的参照品种时，应与原参熊品种核对，确认无误后用，
注3：对于附录（小未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应参照品种，9操作程序
9.1重复设置
设置2次生物学重复。
9.2样品准备
种子样品的钎样、分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。每个品种分取2个样品，每个样品30个个体（种子、叶片或其他器官组织），等量混合。9. 3 INA 提取
采用CTAB法：取动嫩组织混合样0.2g，放人1.5mI.离心管中，在液氮中研碎；或将种子研碎，放人1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加人400μl，混匀样品。将离心管置于65%金属浴或水裕锅中，保温30min后取下。向离心管中加人400μL24：1氯仿一异戊醇（V：V），振荡混匀。10000离心10min。将上清液200uL转人另一只1.5mL离心管，加人400μl，20%预冷无水乙醇沉淀DNA，10000g离心］min，弃上滑液.加入500μl.乙醇-乙酸铵溶液.6000g离心5min收集沉淀，加入100μLTE(pH8.0)溶液溶解DVA，检测DNA浓度。20%保存。注：其他所获IINA质盘能够满足PCR扩消需要的NA提取方法都适用于本标准，9.4ICR扩增
9.4.1反应体系
25μL的反应体,含每种dVIP0.25mtol/L,正向引物、反向引物各0.4μmoi/I.,IagDNA聚合酶1.0U.1×PCR缓冲液(不含Mg*+）,MgCl1.5mmol/L,样品DNAJ0-40ng，利用毛细管电泳荧光检测时使荧光标记的引物。引物的光染料种类附录C注：反应体系你体积可以根据具体情况进行调整。9.4.2反应程序
94%预变性4min；94℃变性45，65℃退火45s，72℃延伸158，每循坏降1℃，共15个循环；94℃变性45，50℃退火30s，72%延伸45s，共30个循环；72%延伸10min，4℃保存9.5PCR产物检测
9.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.5.1.1清洗玻璃板Www.bzxZ.net
将坡璃板清洗十净，用去离子水冲洗后晾下。用无水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦下，在长板上涂上0.5ml.亲和硅烷工作液，带叫槽的短板上涂0.51mL剥离裤烷T作液。操竹过程防止两块玻璃板互相污染。
9.5.1.2组装玻璃板
玻璃板彻底十燥后，将其纠装成电泳胶板，用水平仪调平。垫片厚度为0.4mm。9. 5. 1. 3制胶
在100ml.6.0%PAGE胶中分别加人TEMED50，L和新配制的10%过硫酸铵溶液500uL，迅速混勾后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻入胶液约0.4cm。灌胶过程中防止出现气泡。使胶液聚合全少1h以上，胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拨出2
梳子，门水清洗十净各用、
9.5.1.4预电泳
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将胶板安装于电泳树上：.商.1:槽中加人约800mL预热举65℃的0.25×TBE缓冲液，便其超过凝胶顶部3cm，向下中加人800m，1×I3F缓冲液。在60W恒功率下，预电泳10min20nain。9.5.1.5样品制备
在25LPCR样品巾加入10uI.上样缓冲液，混匀，在水锅或PCR仪1：95℃变性5min，取出迅速暨于碎冰上。
9.5.1.6电泳
用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端儿次，清除气泡聚丙烯酰胺碎片。将鲨色齿梳广梳齿端凝胶1mn～2n。每-个加样孔点人2ul-~3uL样品。除得测样品外，还应同时加人参照品种扩增产物，在50W~80W恒功率下电泳，使凝胶涩度保持在约50℃。电泳1.5h~2.5h(电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝咬附着的长玻璃极准备固定。注：具体功察大小根据电泳槽的规格型号和实验空室溢设定。9.5.1.7银染
固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加人约1000ml银染固定液，使固定液没过凝a
胶，在摇床上轻轻显动 20 min~-30 min;漂洗：取山玻璃板，在县离子水中漂1次～2次，每次2ni6
染色：将玻璃板置放人约1000mL染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻异动30min；c
漂洗：在去离子水中快速漂洗·时间不超过10$d)
显影：将玻璃板在预冷的显影液中轻轻晃动至1现清晰带纹：定影：将凝胶在固定液中定影5min;漂洗：在太离子水中漂洗1min。9.5.2毛细管电泳荧光检测
9.5.2.1PCR产物样品准备
将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和R(X荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1uL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1μl..17.50分子量内标和8.9μL去离子甲胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DVA分析假上。
除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括2个~3个参照品种的扩增产物。注：不同炭光标记的扩增产物的最适稀释音数最好道过泛纤臂电泳荧光检测顽试验确定。9.5.2.2开机准备
打开DNA分析仪、检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放于样品架基座上。打开数据收集软件。
9.5.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入忆泳板名称，选摔适合的程序和电泳板炎型，翰人样品编号或名称。
9.5.2.4运行程序
DNA分析仪自动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器巾。10等位变异数据采集
10.1数据表示
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样品每个SSR位点的等位变异采扩增片段大小的形式表示。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测将某位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位宵进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异人小。10.3毛细管电泳荧光检测
使TNA分析仪的片段分析软件，读山每个位点每个样品的等位变异大小数据。比较参照品种的等位变并人小数据与附录C中参照品种相成的数据两者之问的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变分大小。示例1：参照品种\w3”\W13-8\在cnu_ml39a位点.上的等位变异大小分别为155bp和159bp.附录（比l“w3\\W13-8\相应的数据分别为157bp和161bp系统误差为2hp。个待测样品的等位变异人小原始数据为157lp则待测样品在该位点上的等位变异数据应为159 bp。示例2:参照品利\W3”\W138”在cnu_m016a位点上的等位变异大小为85hp和173b.附求（中r\W3\、\W:3·8\相应的数据分别为185bp和173bp+系统误差为0hp。一个待测样品的等位变异大小原始数据为183bp.则待测样品在该位点上的等位变异数据应为183bp.10.4结果记录
纯合位点的等位变异记录为X/X.杂合位点的等位变异记录为X/Y。其中X,Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0。示例1：一个品种在cnu_m139a位点上有」个等位变异，人小为157bp.谢该品种在该位点t.的等位变异数据记录为157/157
示例2：一个品种在cnl_m016a位点上有2个等位变异，大小分别为183b.187bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为183/187。
10.5数据处理
一个位点2次重复检测数据相同时，该数据即为该位点的等位变异数据。2次蛋复不一致时.增加第三个重复，以其中2个重复相向的检测数据为该位点的等位变异数据。当3次重复结果都不相同时，该位点视为无效位点。
11判定标准
依据30对引物的检测结果进行判定：a）品种间差异位点数23,判定为不同品种；b）品种间差异位点数<3,判定为近似品种，A.1主要仪器设备
A. 1. 1 PCR 扩增仪。
A.1.2高压电泳仪。
A.1.3电泳槽及配查的制胶附件。A.1.4水·平电泳槽及配套的制胶附件。附录A
(规范性附录）
仪器设备及试剂
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A.1.5DNA分析仪：基丁毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件.能够分辨最少1个核凸酸的差异。
A.1.6高速离心机。
A.1.7水平摇床。
A.1.8胶片观察灯。
A.1.9 电了天半。
A.1.10微量移液器。
A.1.11紫外分光光度计。
高压灭菌锅。
酸度评。
水浴锅或金属浴。
制冰机。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。A.2.1十六烷基二乙基溴化铵,
聚乙烯吡咯烷酮。
二氯甲烷，
A.2.4异醇。
A.2.5乙‘胺四乙酸二钠。
三羟时基氨基甲烷。
A.2.7浓盐酸、
A.2.8氨氧化钠。
A.2. 9Tag DNA 聚合酶
A. 2. 10 10×PCR缓冲液。
A.2.11氯化镁。
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氯化钠。
4种脱氧核糖核者酸。
SSR引物。
矿物油。
琼脂糖。
核酸染色剂。
太离子酰胺。
溴酚蓝。
三甲苯青。
甲义双丙烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
尿索。
亲和硅烷。
剥离硅烷。
无水乙醇。
四甲基乙二胺，
过硫酸铵。
冰醋酸。
乙酸铵，
硝酸银。
DNA分析仪用聚丙烯酰胺胶液。
DNA分析仪用分子量内标：最人分子量500bp，Liz标记。A.2.35
6DNA分析仪用光谱校准基质：包括G-FAM、TAMRA、HEX利ROX4种荧光染料标记的A.2.36
DNA片段。
A.2.37DNA分析仪用电泳缓冲液。6
B.1DNA提取溶液的配制
B.1.11mol/L氢氧化钠溶液
附录B
[规范性附录]
溶液配制
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称取40.0g氢氧化钠，溶丁800mL去离了水中.冷却全室温，定容至1000mL。B.1.20.5mol/L盐酸溶液
量取25ml36%～38%浓盐酸.加去离子水定容至500mL，B. 1. 3 0. 5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐tpII 8. 0)溶液称取186.1k乙二胺四乙酸二钠盐，加入800mL去离了水，加人20g氢氧化钠.搅拌。待乙二胺四乙酸钠盐完余溶解后，冷却至室温。再用氧氧化钠溶液（I.1.1)准碗调pTI至8.0，定容至1000ml。在103.4kPat121℃)条件下火菌20min。B. 1. 41 D1ol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸[pH1 8. 0]溶液称取60.55g二羟甲基氨基甲烷，溶于4001rL去离子水中,用献酸溶液(13.1.2)调pII至8.0.定容至500ml，在103.4kPa(121℃)条件下火菌20ninB. 1.5 DNA 提取液
分别称取20.心g十六烷基乙基化铵和81.82g氯化钠，分别加入40ml.乙二胺四乙酸钠盐溶液(pH8.0)(B.1.3)、100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0)(I.1.4)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加人800mL去离子水.65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa(121c）条件下灭菌20min。于4保存，B.1.6三氯甲烷一异戊醇混合液
V(三氯甲烷）：V(异戊醇)=24：1B.1.7乙醇-乙酸铵溶液
称取154.6mg乙酸铵,加人140mL无水乙醇,用么离子水睿至200mLB.1.8TE缓冲液
分别量取5 1nL羟甲基氨基甲烷酸溶液(pH8.0)(B. 1. 4)和i1ml.乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)(B.1.3),定容至500mL,在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃F保存。B.2PCR扩增溶液的配制
B. 2. 1 dNTP 溶液
用超纯水分别配制dATP、dTTP、dGTP和dTP4种脱氧核糖核苷酸终浓度为100mmol/L的储存液。分别量取4种储存液20μL混合，用120μl.超纯水定容，配制成每种核苷酸终浓度为10mmnl/1的.作液，在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min，于一20℃保存，注：也可使用满足试验要求的商品dNTP溶液。B.2.2SSR 引物溶液
用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为5umol/I.的工作液。B.2.3氯化镁溶液
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称取1.190g氯化镁，用离子水溶解定容至500mL，配制成25mmol/1.的工作液。在103.4kPa(121℃）条件\下灭菌20 min，一20℃保存。注；也可使用满足试验要求的商品熟化镁溶液。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3. 110× TBE缓冲液
分别称取108.0g三羟甲基氢基甲烷和55.0g硼酸，济于800ml.去离子水.加人37mL乙一胺四乙酸二钠盐溶液（pl18.0)（B.1.3).定容至1000ml。B.3.240%丙烯酰胺溶液
分别称取190.0内烯酰胺和10.0g甲义双丙烯酰胺，溶于400ml去离子水中.定容至500mLB.3.36%变性聚丙烯酰胺胶溶液
称取420.0g尿素，用去离子水辫解，分别加入100ml.10×TBE缓冲液（B3.1)和150tmL40%内烯酰胺溶液（B.3.2)，定容至1000ml。B.3.4亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75mL无水乙醇和250μl.冰醋酸，用去离子水定容至50mL，B.3.5亲和硅烷工作液
分别量取5μL亲和硅烧和1ml。亲和硅烷缓冲波，混勾。B.3.6剥离硅烷工作液
分别量取98ml.三氯甲烷游液和2ml.二甲基二氮硅烷浒液，混匀。B.3.710%过硫酸铵溶液
称取1.0g过硫酸铵，济于10ml.去离子水中，混勾。于一4℃保存。B. 3. 81 ×TBE 缓冲液
量取500mL10×TBF缓冲液（B.3.1)，用去离了水定容至5000mL。B. 3. 96×加样缓冲液
分别称取0.25g溴酚蓝和0.25g二苯青，分别加入98mL去离了甲酰胺和1ml.乙一胺四乙酸二钠盐溶液（pJI8.0），搅拌溶解。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取100ml.冰酷酸，加人1000ml去离了水。B.4.2染色液
称取1.0g硝酸，溶于1000ml.去离子水。B.4.3显影液
称取10g氢鐵化钠，溶丁100nmL去离子水巾，再加人5ml甲醛，8
核心引物表（.1。
连锁群
cnu_ml39a
ua_m086a
nia_m098a
nia_ml38a
cnlmM6#
附录C
【规范性附录】
核心引物
表 C. 1 核心引物
引物序列(5'-3'）
F: FCAAGKGCAAAAACATTGG
R: TGGFGTTAGGGTTTAAGGTTGTGG
FAGTICCTICICCAOXTTGT
R:TGCTIGTGGTCAATCTCTCA
F:GAGTUCAGTCAALAGAAGCA
R TCTXACTTCACAACAGAA
F:GTTTTAAATGXGIIG
R:GGGATCAAGAGATGTGGGA
F:GCTAAAGGTTTAGTCCAAATAGGATIY:R:GCAAAATGATGXCCCATAAA
S'TAMRA
S'TAMRA
iiKAoNiiKAca
NY/T2476—2013
话266
参照品种
金贝2
福尔青
中白83
绿垦大棵菜
黄心娃
精选中
精逆中自81
北京大心
金贝-2
津绿3
西388~1
267：-
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