NY/T 2477-2013
基本信息
标准号： NY/T 2477-2013
中文名称：百合品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
标准类别：农业行业标准(NY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
NY/T 2477-2013 百合品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
NY/T2477-2013
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标准内容
ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2477—2013
百合品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of lily varieties-SSR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共科国农业部
1范围
规范性引用文件.
术语和定义
仪器设备及试剂
溶浚配制
引物·
8参照品种及其使用.
9操作程序
10等位变异数据采集
11判定标准
附录A(规范性附录)
附录 B(规范性附录)
附录C（规范性附录)
附录 D(资料性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制
核心引物
叁照品种名单
NY/T 2477—2013
NY/T 2477--2013
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利、本文件的发布机构不承扣识别这些专利责任。本标雅由农业部种子管理局提出，本标准电全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC：277)归口：本标滩越草单位：中国农业科学院蔬荔花中研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：明军、葛完,衰袁索霞、刘寿、徐笛锋。1范围
百合品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T2477—2013
本标准规定丁利用简单重复序列（Sinplesequence:rcpeats)分子标记进行百合属（lilizmI）品种鉴定的试验方法、数据记录及判定标准本标准适川T石合品种DNA分子标记SSR数据采集和品种鉴定2规范性引用文件
下列件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仅注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修单)适用丁本文件。NY/T1656.6-2008花卉检验技术规范GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳霆性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物coreprimers
指人工合成的，多态性，稳定性、重复性等综合特性较好、作为DNA指纹鉴定必须选川的一组引物。3.2
参照品种reference samples
参照品种是指多样性好，核心引物位点扩增片段大小已知的一组品种。参照品种用于比对待测样品在某个SSR位点上等位变异扩增片段的大小，校止不同仪器设备和不同实验空闻检测数据的系统误差。参照品种以无性繁殖方式进行殖，专人保管。4原理
SSR广泛分布于百合基因组中，不间品种间每个SSR位点重复单位的数可能不同，针对两侧序列高度保守的特点，设计对特异引物，利用PCR技术聚台酶链反应i，Polymerasechainreactiun)对重复序列进行扩增，在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或若炭光染料标记加以区分。内此，根据SSR位点的多态性利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定百合品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录B
7引物
引物相关信息见附录C.
-iiKAoNhiKAca
NY/T2477--2013
8参照品种及其使用
参照品种的名单参迅附录D
在进行等位变异检测时，应同时包括机应参照品种的PCR扩增产物。注1：问一名称不同来源的参照品种的基位点上的等位变异可能不相同·在使用其他来源的鑫照品种时，意与原参照语种核对,确认无误后假用。
注2:对于附录C 功未包括的等位变异,应按本标准方法,确定其大小和对成参照品种。9操作程序
9.1样品准备
9.1.1按照NY/T 1656.6--2008 的规定进行样品的准备。9.1.2从每份样品随机抽取5株以上的个体，混合分析：9.2 DNA 握取
从幼叶提取DNA可采用以下方法：选取0.2植株幼叶置于i.5rnL离心管,加液氮研磨至粉米：a
离心管中加人700L预热（65℃)2%CAB提取液，轻摇勾；h)
65℃水浴1h.每隔15min轻摇1次；dl)
冷却后灿入700μI.氯伤-异戊醇（24：1),混句5min;10 000 g 离心 10 min;
吸取上清液到1.5nL的离心管中，加人700uL预冷异丙醇，混旬片置-F4℃沉淀1或f）
-20℃30Iin
10 000 g 离心 1C mitl;
弃上清液，用了5乙醇洗涤后晾干；h)
i)加入 100 μ ddH,0,1μ RNAase.37C水浴 1h;i）待充分解后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度；k）稀释成工作液或-20℃保存备用；注：以上为推存的一种DNA提取方法。所获INA质量能够符合PCR扩增需要的IONA提取方法都适H丁本标准。9.3PCR扩增
9.3.1反应体系
反应体系总体积为20uL，反应组分配制见表1DNA分析仪检测时，使用荧光标记引物，引物的荧光染料种类见附录C.
表 1PCR扩增反应体系
反应组分
正向引物
反底引物
10X Faq Buffer(↑ Mg*+)
TagTNA聚合
9. 3.2反应程序
原浓度
202g/pL
10 penel/ L
10 anul/ L
2. 5 mincl/L
5. 0 U/ pL
加样体积.
终浓度
0. 3 rol/ L
0. 2 m1rl/1.
反应程序可根据引物不同选下列程序中的种，退火温度可根据附录C推荐的引物退火温度设定。程序1:94%预变性4min1;94%变性30s,推荐的退火温度退火30s.72℃延伸30,35个循环;72℃2
延伸7min;4℃保存。
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程序2：降落（Touchdown）PCR增程序：94℃预变性4uin94℃变性30s.65%退火3Cs.72℃延伸308，10个循环存个循环降低1%：94%变性30s，55℃退火30，72℃延伸30%，30个循环：72℃延伸7 min;4℃ 保存。
9.4等位变异检测
9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.4.1.1清洗玻璃板
将长，短玻璃板清洗下净，去离了水冲洗片惊干。用无水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦干。在长板工涂0.mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剃离硅烷工作液。操作过程巾防L两块玻腐板互相污染：
9.4.1.2组装电泳板
待玻板彻底下燥组装电泳板，并用水平仪调平，9.4.1.3灌胶
取60ml.6%的变性聚内烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的H量和合适的灌胶方式）300LAPS和60μT.TEMED轻轻混勺，把板的一边拾起将胶缓缓的灌人，当胶到底部后将板放置水平，将梳子平端摘人适当的位置，聚合1h后而于电泳。灌胶过程中应防止出现气泡。9.4.1.4预电泳
将梳子小心拔山，并把碎胶清理十净，然后擦干净玻璃板。将电泳槽装配好后，在中泳槽中加入1TBE，在恒功率80W条件下预电30min。9. 4. 1. 5 变性
在PCR产物中加入10ul.6×加样缓冲液，混句虎，在PCR仪上05℃变性5min，取出，迅速置于碎冰上,冷却10 inin以上。
9.4.1.6电泳
预电泳结束后，清除胶面的气泡及杂质.将鲨色齿梳齿端插入凝胶2m，每-个加样孔点人5l.样品。8CW恒功率电泳至上部的指示带(二甲背)到达胶板的中，下部。电泳结束后.小心分开调块玻璃板，注：贝体功率大小根据电泳槽的规格型弓和实验空究温设定。9.4.1.7银染
a）固定：带凝胶长板在固定液中轻轻晃动6min：h）染色：染色液中轻轻耀蔻6 nin;漂洗：蒸馏水快速漂洗3051
d）晟影：显影液中轻轻光动至带纹出现；定影：固定液定影2min
f）漂洗：蒸水漂洗1min.
9.4.2毛细管电泳荧光检测
9.4.2.1样品准备
将带有荧光标记的PCR产物稀释创合适的检测浓度.6FAM和HEX荧光标记的FCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释1C倍。分别取等体积的上述4种稀释濑混合·从中吸取1μI.加人到IDNA分析仪深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1LLIZ500分子量内标和8.9μ去离子用酰胺。除待测样品外，应同时包括参照品种的扩增产物。将样品在PCR仪上95℃变性5min，立即取出置丁冰浴中，冷却J0min以上。瞬时离心后：工机电泳。
注：不同荧光标记的扩增产物的适窄稀释倍数道过颠试验确定。3
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9.4.2.2开机准备
打开DVA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板放于样品架基座上。打开数据收集软件。
9.4.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输人样品编号或名称。
9.4.2.4运行程序
户动运行程序，DVA分析仪自动收集记录毛细管电泳数据。10等位变异数据采集
10.1数据格式
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测方法将待测样品和相应的参照品种某一位点扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。10.3毛细管电泳荧光检测
使TDNA分析仪的片段分析软件，读出待测品种与对应参照品种的等位变异数据。比较参照品种的等位变异大小数据与附录C中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。10.4结果记录
纯合位点的等位变异扩增片段数据记录为X/X，其中X为该位点等位变另扩增片段大小：杂合位点的等位变异扩增片段数据记录为X/Y.其中X、Y分别为该位点上2个不同的等位变异.小片段数据在前，人片段数据在后，无效位点的等位变异数据记录为0/0。示例1：
.个品利的一个SSR位点为纯合位点，等位变异扩增片段大小为120L仰，则该品种在该位点上的等位变异扩增片段数据记录为120/120
示例2：
一个品种的一个SSR位点为杂合位点，2个等位变异扩增片段大小分别为L20bI126bp.则该品种在该位点上的等位变异扩谱片段数据记录为120/126。11判定标准
品种鉴定包括对2个或2个以上的品种同时进行检测（\直接比较”）和对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比较\)两种情况，后者也适门丁新品种测试中利用SSR标记选择近似品种的情况。11.1直接比较
用附录（中20对核心引物检测，获得待测品种在这些引物位点的等位变异数据.利用这些数据行品种间比较：
）品种间差异位点数23,判定为不同品种：b）品种问差异位点数一2或1,判定为相品种；）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种，对于11.1h)和11.1c）的情况：应按照GB/T19557.1给出的原测进行山间试验.确定品种问在形态性状上是否荐在明显差异。
11.2数据库比较
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先用附录C中2C对核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位变异数据.利用这些数据和数据库中品种行比较；
a）品种间差导位点数3,判定为不同品种；b）品种间差异位点数一2或1,判定为相近品种；品种间差异位点数0,判定为疑同品种。c
对于11.2b)和11.2c>的情况-应按照GB/T19557.1的规定进行用问试验，确定品种闻在形态性状上是否存在明显差异。
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A.1仪器设备
A. 1. 1 PCR 扩增仪,
A.1.2测序电泳槽及配粪的制胶附件。A. 1. 3 高压泳仪。
A.1.4水平摇床。
A.1.5胶片规察灯箱。
A.1.6 电子天平。
微量移液器。
磁力搅拌器。
电磁炉。
A. 1. 10 微波炉。
高压火菌锅。
FH酸度计
台式高速离心机。
制冰机。
的差异。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
附录A
【规范性附录】
仪器设备及试剂
DNA分析仪：基F毛细管电泳，有I)NA片段分析功能和数据分析软件：能够分辨1个核背A. 1. 17
水浴锅或金属浴，
冰箱。
紫外分光光度计
A.2试剂
A.2.1乙二胺四乙酸二钠。
A.2.2 Tris 碱。
A.2.3浓盐酸。
A.2.4氨氧化钠。
A.2.5TaqDNA聚合酶Buffer：含Mg-。A.2.6四种脱氧核芥酸(dNTPs)。A.2.7 Taq DNA 聚合酶。
A.2.8 SSR 引物,
A.2.9去离子甲酰胺。
溴酚蓝。
二甲辈背，
煎糖。
A.2.13印叉双内烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
A.2.17亲和硅烷：97%。
8剥离硅烷：2%二甲基二氮硅烷。A.2.18
无水血醇。
A.2.20四甲基乙-胺(TEMED)。
过硫酸铵。
A.2.22冰醋酸。
硝酸银。
A.2.24甲醛溶液。
「六烷基三乙基溴化铵(CTAB)。聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
氯仿。
异戊醇。
A.2.29异丙醇。
A. 2. 30 RNA酶。
A.2.31 琼脂糖。
腋氮。
LIZ500分子量内标。
A.2.34DNA分析仪用丙烯酰胺胶液(P)P-4胶）。NY/T 2477—-2013
5DNA分析仪用光谱校准基质.包括6·FAM、TAMRA、IIEX和R()X4种荧光标记的UNA片A.2.35
DNA分析仪专用电泳缓冲液，
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B.1DNA提取溶液的配制
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B. 1. 1 0. 5 mol/L RDTA 溶液称取185.1gNaEDTA，2H溶于800mL水中，用剧休Va()H调pH至8.0.定容至1000ml..高压灭菌。
班. 1. 21 mol/L Tris-HCI 溶液称取 60. 55g Tris碱溶于适量水中,加HCI调pH至 8. 0.定容至500mI.,商压灭菌，B. 1. 30. 5 mol/ L HCI 溶液
量取25ml浓盐酸，廊水定容至500mLB. 1. 4 2%CTABbzxz.net
分别称取CTAB20g，NaCl81.816g.PVP20g+分别量取1moi/LIris-ICI溶液（pH8.0)）100ml.,0.5mol/LFDTA溶液(pH8.0)40 tmL,定容至1C00ml.。B. 1. 5 5 mul/ L, NaCI 溶液
称胶146g固体NaCl辫于水中，加水定容至500mL.1.6氯仿—异戊醇（24：1)
分别量取240ml.氯仿和10mL异醇，将两者混勾，B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1SSR引物
用超纯水分别配制前引物和片引物终浓度均为10μmol/L的储存液-各量取10ul.混合。注：干粉配制前座首先快速离心。B.2.26×加样缓冲液
分别量取去离子甲酰胺49nl.,0.5mol/1.的EDTA溶液（pH8.0)1ml.,分别称取漠酚兰0.125g二甲举青0.125g，蔗糖40-将各组分混勾。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%PAGE胶
分别称取I90g丙烯酰胺和i0g甲义双丙烯酰胺，加水定容至500nl.B.3. 2 6. 0% PAGE胶
称取120g尿素，分别量取10×TBE缓冲液1C0tmL和4C%PAGE胶150mL定容至1000mLB.3.3亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250uL冰醋酸，加水定容至50mI。B.3.4亲和硅烷工作液
在Iml.亲和硅烷缓冲液中加人5μl.Binding原液，混勾。B.3.5剥离硅烷工作液
2%...甲基二氯硅烷
B.3.610%过硫酸铵溶液
VY/T2477—2013
称取10g过硫酸铵加水定容至1001nL，分装到2ml.离心管中-在1℃最多保存2周~-3周，若需长期保存应置于20%。
B.3.710×TBE缓冲液
分别称取Tris碱108g，硼酸55g.量取0.5mol/LEDTA溶液37mL：定容至1000ml.8×TIF缓冲液
量取10.×TBE缓冲液5C0mL.加水定容至5000ml-。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取200ml.无水乙醇，10mL冰醋酸.加水定容至1000mLB.4.2染色液
称取3g硝酸银，量取3nl.甲醛，加水定容至2000mLB.4.3显影液
称取3Cg氯氧化钠，量取4ml.甲醛，加水定容至2000ml.。9
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SSR分子标记法
Identification of lily varieties-SSR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共科国农业部
1范围
规范性引用文件.
术语和定义
仪器设备及试剂
溶浚配制
引物·
8参照品种及其使用.
9操作程序
10等位变异数据采集
11判定标准
附录A(规范性附录)
附录 B(规范性附录)
附录C（规范性附录)
附录 D(资料性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制
核心引物
叁照品种名单
NY/T 2477—2013
NY/T 2477--2013
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利、本文件的发布机构不承扣识别这些专利责任。本标雅由农业部种子管理局提出，本标准电全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC：277)归口：本标滩越草单位：中国农业科学院蔬荔花中研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：明军、葛完,衰袁索霞、刘寿、徐笛锋。1范围
百合品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T2477—2013
本标准规定丁利用简单重复序列（Sinplesequence:rcpeats)分子标记进行百合属（lilizmI）品种鉴定的试验方法、数据记录及判定标准本标准适川T石合品种DNA分子标记SSR数据采集和品种鉴定2规范性引用文件
下列件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仅注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修单)适用丁本文件。NY/T1656.6-2008花卉检验技术规范GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳霆性测试指南总则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
核心引物coreprimers
指人工合成的，多态性，稳定性、重复性等综合特性较好、作为DNA指纹鉴定必须选川的一组引物。3.2
参照品种reference samples
参照品种是指多样性好，核心引物位点扩增片段大小已知的一组品种。参照品种用于比对待测样品在某个SSR位点上等位变异扩增片段的大小，校止不同仪器设备和不同实验空闻检测数据的系统误差。参照品种以无性繁殖方式进行殖，专人保管。4原理
SSR广泛分布于百合基因组中，不间品种间每个SSR位点重复单位的数可能不同，针对两侧序列高度保守的特点，设计对特异引物，利用PCR技术聚台酶链反应i，Polymerasechainreactiun)对重复序列进行扩增，在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或若炭光染料标记加以区分。内此，根据SSR位点的多态性利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定百合品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录B
7引物
引物相关信息见附录C.
-iiKAoNhiKAca
NY/T2477--2013
8参照品种及其使用
参照品种的名单参迅附录D
在进行等位变异检测时，应同时包括机应参照品种的PCR扩增产物。注1：问一名称不同来源的参照品种的基位点上的等位变异可能不相同·在使用其他来源的鑫照品种时，意与原参照语种核对,确认无误后假用。
注2:对于附录C 功未包括的等位变异,应按本标准方法,确定其大小和对成参照品种。9操作程序
9.1样品准备
9.1.1按照NY/T 1656.6--2008 的规定进行样品的准备。9.1.2从每份样品随机抽取5株以上的个体，混合分析：9.2 DNA 握取
从幼叶提取DNA可采用以下方法：选取0.2植株幼叶置于i.5rnL离心管,加液氮研磨至粉米：a
离心管中加人700L预热（65℃)2%CAB提取液，轻摇勾；h)
65℃水浴1h.每隔15min轻摇1次；dl)
冷却后灿入700μI.氯伤-异戊醇（24：1),混句5min;10 000 g 离心 10 min;
吸取上清液到1.5nL的离心管中，加人700uL预冷异丙醇，混旬片置-F4℃沉淀1或f）
-20℃30Iin
10 000 g 离心 1C mitl;
弃上清液，用了5乙醇洗涤后晾干；h)
i)加入 100 μ ddH,0,1μ RNAase.37C水浴 1h;i）待充分解后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度；k）稀释成工作液或-20℃保存备用；注：以上为推存的一种DNA提取方法。所获INA质量能够符合PCR扩增需要的IONA提取方法都适H丁本标准。9.3PCR扩增
9.3.1反应体系
反应体系总体积为20uL，反应组分配制见表1DNA分析仪检测时，使用荧光标记引物，引物的荧光染料种类见附录C.
表 1PCR扩增反应体系
反应组分
正向引物
反底引物
10X Faq Buffer(↑ Mg*+)
TagTNA聚合
9. 3.2反应程序
原浓度
202g/pL
10 penel/ L
10 anul/ L
2. 5 mincl/L
5. 0 U/ pL
加样体积.
终浓度
0. 3 rol/ L
0. 2 m1rl/1.
反应程序可根据引物不同选下列程序中的种，退火温度可根据附录C推荐的引物退火温度设定。程序1:94%预变性4min1;94%变性30s,推荐的退火温度退火30s.72℃延伸30,35个循环;72℃2
延伸7min;4℃保存。
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程序2：降落（Touchdown）PCR增程序：94℃预变性4uin94℃变性30s.65%退火3Cs.72℃延伸308，10个循环存个循环降低1%：94%变性30s，55℃退火30，72℃延伸30%，30个循环：72℃延伸7 min;4℃ 保存。
9.4等位变异检测
9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测9.4.1.1清洗玻璃板
将长，短玻璃板清洗下净，去离了水冲洗片惊干。用无水乙醇擦洗两遍，吸水纸擦干。在长板工涂0.mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剃离硅烷工作液。操作过程巾防L两块玻腐板互相污染：
9.4.1.2组装电泳板
待玻板彻底下燥组装电泳板，并用水平仪调平，9.4.1.3灌胶
取60ml.6%的变性聚内烯酰胺胶（根据不同型号的电泳槽确定胶的H量和合适的灌胶方式）300LAPS和60μT.TEMED轻轻混勺，把板的一边拾起将胶缓缓的灌人，当胶到底部后将板放置水平，将梳子平端摘人适当的位置，聚合1h后而于电泳。灌胶过程中应防止出现气泡。9.4.1.4预电泳
将梳子小心拔山，并把碎胶清理十净，然后擦干净玻璃板。将电泳槽装配好后，在中泳槽中加入1TBE，在恒功率80W条件下预电30min。9. 4. 1. 5 变性
在PCR产物中加入10ul.6×加样缓冲液，混句虎，在PCR仪上05℃变性5min，取出，迅速置于碎冰上,冷却10 inin以上。
9.4.1.6电泳
预电泳结束后，清除胶面的气泡及杂质.将鲨色齿梳齿端插入凝胶2m，每-个加样孔点人5l.样品。8CW恒功率电泳至上部的指示带(二甲背)到达胶板的中，下部。电泳结束后.小心分开调块玻璃板，注：贝体功率大小根据电泳槽的规格型弓和实验空究温设定。9.4.1.7银染
a）固定：带凝胶长板在固定液中轻轻晃动6min：h）染色：染色液中轻轻耀蔻6 nin;漂洗：蒸馏水快速漂洗3051
d）晟影：显影液中轻轻光动至带纹出现；定影：固定液定影2min
f）漂洗：蒸水漂洗1min.
9.4.2毛细管电泳荧光检测
9.4.2.1样品准备
将带有荧光标记的PCR产物稀释创合适的检测浓度.6FAM和HEX荧光标记的FCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释1C倍。分别取等体积的上述4种稀释濑混合·从中吸取1μI.加人到IDNA分析仪深孔板孔中。板中各孔分别加人0.1LLIZ500分子量内标和8.9μ去离子用酰胺。除待测样品外，应同时包括参照品种的扩增产物。将样品在PCR仪上95℃变性5min，立即取出置丁冰浴中，冷却J0min以上。瞬时离心后：工机电泳。
注：不同荧光标记的扩增产物的适窄稀释倍数道过颠试验确定。3
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9.4.2.2开机准备
打开DVA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板放于样品架基座上。打开数据收集软件。
9.4.2.3编板
按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输人样品编号或名称。
9.4.2.4运行程序
户动运行程序，DVA分析仪自动收集记录毛细管电泳数据。10等位变异数据采集
10.1数据格式
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。10.2变性聚丙烯凝胶电泳与银染检测方法将待测样品和相应的参照品种某一位点扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。10.3毛细管电泳荧光检测
使TDNA分析仪的片段分析软件，读出待测品种与对应参照品种的等位变异数据。比较参照品种的等位变异大小数据与附录C中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，得到的数据即为待测样品该位点的等位变异大小。10.4结果记录
纯合位点的等位变异扩增片段数据记录为X/X，其中X为该位点等位变另扩增片段大小：杂合位点的等位变异扩增片段数据记录为X/Y.其中X、Y分别为该位点上2个不同的等位变异.小片段数据在前，人片段数据在后，无效位点的等位变异数据记录为0/0。示例1：
.个品利的一个SSR位点为纯合位点，等位变异扩增片段大小为120L仰，则该品种在该位点上的等位变异扩增片段数据记录为120/120
示例2：
一个品种的一个SSR位点为杂合位点，2个等位变异扩增片段大小分别为L20bI126bp.则该品种在该位点上的等位变异扩谱片段数据记录为120/126。11判定标准
品种鉴定包括对2个或2个以上的品种同时进行检测（\直接比较”）和对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对（“数据库比较\)两种情况，后者也适门丁新品种测试中利用SSR标记选择近似品种的情况。11.1直接比较
用附录（中20对核心引物检测，获得待测品种在这些引物位点的等位变异数据.利用这些数据行品种间比较：
）品种间差异位点数23,判定为不同品种：b）品种问差异位点数一2或1,判定为相品种；）品种间差异位点数一0,判定为疑同品种，对于11.1h)和11.1c）的情况：应按照GB/T19557.1给出的原测进行山间试验.确定品种问在形态性状上是否荐在明显差异。
11.2数据库比较
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先用附录C中2C对核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位变异数据.利用这些数据和数据库中品种行比较；
a）品种间差导位点数3,判定为不同品种；b）品种间差异位点数一2或1,判定为相近品种；品种间差异位点数0,判定为疑同品种。c
对于11.2b)和11.2c>的情况-应按照GB/T19557.1的规定进行用问试验，确定品种闻在形态性状上是否存在明显差异。
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A.1仪器设备
A. 1. 1 PCR 扩增仪,
A.1.2测序电泳槽及配粪的制胶附件。A. 1. 3 高压泳仪。
A.1.4水平摇床。
A.1.5胶片规察灯箱。
A.1.6 电子天平。
微量移液器。
磁力搅拌器。
电磁炉。
A. 1. 10 微波炉。
高压火菌锅。
FH酸度计
台式高速离心机。
制冰机。
的差异。
凝胶成像系统或紫外透射仪。
附录A
【规范性附录】
仪器设备及试剂
DNA分析仪：基F毛细管电泳，有I)NA片段分析功能和数据分析软件：能够分辨1个核背A. 1. 17
水浴锅或金属浴，
冰箱。
紫外分光光度计
A.2试剂
A.2.1乙二胺四乙酸二钠。
A.2.2 Tris 碱。
A.2.3浓盐酸。
A.2.4氨氧化钠。
A.2.5TaqDNA聚合酶Buffer：含Mg-。A.2.6四种脱氧核芥酸(dNTPs)。A.2.7 Taq DNA 聚合酶。
A.2.8 SSR 引物,
A.2.9去离子甲酰胺。
溴酚蓝。
二甲辈背，
煎糖。
A.2.13印叉双内烯酰胺。
丙烯酰胺。
硼酸。
A.2.17亲和硅烷：97%。
8剥离硅烷：2%二甲基二氮硅烷。A.2.18
无水血醇。
A.2.20四甲基乙-胺(TEMED)。
过硫酸铵。
A.2.22冰醋酸。
硝酸银。
A.2.24甲醛溶液。
「六烷基三乙基溴化铵(CTAB)。聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。
氯仿。
异戊醇。
A.2.29异丙醇。
A. 2. 30 RNA酶。
A.2.31 琼脂糖。
腋氮。
LIZ500分子量内标。
A.2.34DNA分析仪用丙烯酰胺胶液(P)P-4胶）。NY/T 2477—-2013
5DNA分析仪用光谱校准基质.包括6·FAM、TAMRA、IIEX和R()X4种荧光标记的UNA片A.2.35
DNA分析仪专用电泳缓冲液，
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B.1DNA提取溶液的配制
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B. 1. 1 0. 5 mol/L RDTA 溶液称取185.1gNaEDTA，2H溶于800mL水中，用剧休Va()H调pH至8.0.定容至1000ml..高压灭菌。
班. 1. 21 mol/L Tris-HCI 溶液称取 60. 55g Tris碱溶于适量水中,加HCI调pH至 8. 0.定容至500mI.,商压灭菌，B. 1. 30. 5 mol/ L HCI 溶液
量取25ml浓盐酸，廊水定容至500mLB. 1. 4 2%CTABbzxz.net
分别称取CTAB20g，NaCl81.816g.PVP20g+分别量取1moi/LIris-ICI溶液（pH8.0)）100ml.,0.5mol/LFDTA溶液(pH8.0)40 tmL,定容至1C00ml.。B. 1. 5 5 mul/ L, NaCI 溶液
称胶146g固体NaCl辫于水中，加水定容至500mL.1.6氯仿—异戊醇（24：1)
分别量取240ml.氯仿和10mL异醇，将两者混勾，B.2PCR扩增溶液的配制
B.2.1SSR引物
用超纯水分别配制前引物和片引物终浓度均为10μmol/L的储存液-各量取10ul.混合。注：干粉配制前座首先快速离心。B.2.26×加样缓冲液
分别量取去离子甲酰胺49nl.,0.5mol/1.的EDTA溶液（pH8.0)1ml.,分别称取漠酚兰0.125g二甲举青0.125g，蔗糖40-将各组分混勾。B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制B.3.140%PAGE胶
分别称取I90g丙烯酰胺和i0g甲义双丙烯酰胺，加水定容至500nl.B.3. 2 6. 0% PAGE胶
称取120g尿素，分别量取10×TBE缓冲液1C0tmL和4C%PAGE胶150mL定容至1000mLB.3.3亲和硅烷缓冲液
分别量取49.75ml.无水乙醇和250uL冰醋酸，加水定容至50mI。B.3.4亲和硅烷工作液
在Iml.亲和硅烷缓冲液中加人5μl.Binding原液，混勾。B.3.5剥离硅烷工作液
2%...甲基二氯硅烷
B.3.610%过硫酸铵溶液
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称取10g过硫酸铵加水定容至1001nL，分装到2ml.离心管中-在1℃最多保存2周~-3周，若需长期保存应置于20%。
B.3.710×TBE缓冲液
分别称取Tris碱108g，硼酸55g.量取0.5mol/LEDTA溶液37mL：定容至1000ml.8×TIF缓冲液
量取10.×TBE缓冲液5C0mL.加水定容至5000ml-。B.4银染溶液的配制
B.4.1固定液
量取200ml.无水乙醇，10mL冰醋酸.加水定容至1000mLB.4.2染色液
称取3g硝酸银，量取3nl.甲醛，加水定容至2000mLB.4.3显影液
称取3Cg氯氧化钠，量取4ml.甲醛，加水定容至2000ml.。9
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