NY/T 2478-2013 苹果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 NY/T2478-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS67.080
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2478--2013
苹果品种鉴定技术规程
SSR分子标记法
Identification of apple variety-SSR marker method2013-12-13发布
2014-04-01实施
中华人民共和国农业部
S发布
1范围·
规范性引前文件
术语和定义
原理·
仪器设备及试剂
溶液配制
参照品种及其使用
S操作程序
10等位变导数据采集
11判定方法
附录A(规范性附录)
附录B(规范性附录）
附录((规范性附录)
仪器设备及试剂
溶液配制.
核心引物·
参照品种名单
附录 D(资料性附录)
NY/T 2478—2013
NY/T2478—2013
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标摊山农业部种子管埋局提出。本标准由全国植物新品种测成标准化技术委员会（SAC/TC277)归。本标准起草单位：西北农林科技人学、农业部科技发展中心本标淮主要起草人：高华、李硕碧、王立新、杨江龙、赵政阳、陈企村、杜联盟、张丽I
1范围
苹果品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T2478—2013
本标准规定了利用简单重复序列（SimpleHeuuerereeats.SsR）分子标记进行苹果（MaluduesticuBorkh.）品种鉴定的试验方法，数据采集及判定方法。本标准适用于基丁SSR分子标记的苹果品种[NA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本义件的应用是必不可少的。丸是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件、CB/T19557.1植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南总则CGB/T19557.4植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南苹果3术语和定义
下列术讲和定义适用于本文件。3.1
核心引物
core primer
指人工合成的·多态性.稳定性、重复性等综合特性较好，作为统一用于品种DA指纹鉴定必须选用的一套 SSR 引物。
参照品种referencevariety
参照品种是指多样性好，核心引物位点扩增片段大小已知的组品种。参照品种用于比对待测样品在某个SSR位点上等位变异扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。
4原理
SSR广泛分布于苹果基因红巾，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。对两侧序列高度保守的特点-设i)一对特异引物，利用PcR(案合酶链反应.Polymerasechainlreaction)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数据不同引起的不同长度的PCR扩增片段，在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者炭光染料标记加以区分。因此.根据SSR位点的多态性,利用 PCR扩增和中泳技术可以鉴定苹果品种。5仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录A。
6溶液配制
溶液配制方法见附录R。
7引物
引物相关信息见附录C.
-iiKAoNhiKAca
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8参照品种及其使用
参照品种的名单及代码参见附录D，在进行等位变异检时，应同时包括应参照品科的PCR扩增产物。
注1：间一名称不向来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在说用其他来源的参照品种时，应与原参照品核对，确认无误后使用，
注2：对于附录D中未包括的等位变异，应按本标准方法.确定其大小和对应参照品种。9操作程序
9.1样品准备
每份样品检测3个单株，进行混合分析。9. 2 DNA 提取
）称取果幼叶片C.25%·放人一20℃预冷的研钵中，加人液氮迅速研磨多次，至粉木状后.立即装人2ml.离心管中，依次加入1.5mL预热<70℃）的2%CTAB提取缓冲液、150uL经预热（70C）的CTAB/NaCI溶液、45μL9-筑基乙醇（V：V），充分摇勾；b）65℃恒温水浴1 h.期间每隔10min摇动1次。于4℃12 000g离心15min取上清液，加人等体积的氯仿一异戊醇（2i：1，V：V）.轻轻颠例混勾.静置10min，12000g，c
4℃离心 15 min ;
d）上清液转人另1个2mL离心管中，加人2倍体积一20℃预冷的无水乙醇，颠倒滤勾，在一20℃下静置30切in;120c0g，C离心[5min，弃上清液沉淀的DNA川70%乙醇洗涤2次,再用500μL无水乙醇浸泡洁洗1次；弃乙醇，离心管置于e)
超净工作台风干，溶于20CμL双蒸水中.加10/L的Rnasc1μL,37℃温浴30min;f）再加人等体积的氯仿一异戊醇（24：1，V：V），轻轻混勾，12000g常温离心15min；取上清液，加入2倍体积一20℃预冷的无水乙醇，颠倒混，一20℃静置30min：12000g常温离心15int+弃太上清液；
g）用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200uL双蒸水，一20℃保存备用。注：其他所获DVA质量能够满足PCR抗增需要的IDNA提取方法者适用于本标准，9.3PCR扩增
9.3.1反应体系
15的反应体系含每种dNTP(0.20mmol/L正向引物0.27mul/L，反向引物0.27μmol/L，TagDNA繁合酶1.0U.iXPCR缓冲液（不含Mg-).MgCl1.5mmol/L.样品DNA6ng/μl.。利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记引物。引物的荧光染料种类见附录（。9. 3. 2 反应程序
94℃预变性4ix;94℃变性455,45℃~60℃（根据附录C推荐的引物退火温度设定)退火45s,72℃延伸50s,共35个循环；72℃延钟10min；4C保存。9.4PCR产物检测
9.4.1普通变性聚内烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测9.4.1.1清洗玻璃板
将玻璃板清洗干净,用云离了水冲洗后晾干，用无水乙醇擦洗2遍,吸水纸擦干。在长板上涂0.5mL亲和硅烷工.作液，带凹槽的短板.[涂0.5mL剥离硅烷工作液.操作过稀中防山.2块玻璃板互污染，
9.4.1.2组装电泳板
待玻离板彻底干爆后组装电泳板，并用水乎仪调平。9.4.1.3灌胶
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在60m.6.0%PAGE胶液中分别加人600uL1C%的过硫酸铵和60uLTEMFID).轻轻混勾后灌胶。灌胶过程中防止出现气池。待胶液充满玻璃板火层，将0.1mrm厚鲨色齿梳齿平齐端向单轻轻插入胶液约C.4c。胶液在室温下聚合2h以上。胶聚合后.清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拨山梳子·用水清洗于净备用。
9.4.1.4预电泳
将玻璃板与电泳槽组装，在正极槽（下槽）中加人1XTBE缓冲液800mL在负极槽（上槽）加人1×TRF缓冲液1000mL(缓冲液具体用量视电泳槽型号而定）。80W恒功率预电泳30min9. 4. 1. 5变性
在PCR产物中加人2uL6×加样缓冲液，混勾在PCR仪上95C变性5nu.取出，迅速置于碎冰上,冷却 10 min。
9.4.1.6电泳
清除凝胶顶端气泡，将鲨鱼齿梳齿端插入凝胶2mm。每一个加样孔点人2uL~1l.扩增产物，在胶板两侧点人DNAMarker。除待测样品外，还应同时加人参照品种的扩增产物。在60W~0W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳1.5h～2.5h（电泳时间取灰F扩增片段的大小范用）注：具休功率大小根据电泳槽的现格型号和实验室空温设定，9.4.1.7银染
a）固定：电泳结束后，小心分开2块玻璃板，将附着凝胶的玻璃板浸人固定液中，在摇床上：30g固定20
b）漂洗：取出胶板，放人水洗框中.用蒸馏水漂洗2次，每次漂洗30s；染色：从水洗框中取出胶板.放人染色液fl.在摇床.L30染色20mine
d）漂洗：取出胶板，放人水洗框用蒸馏水漂洗1次，时间不超过10s；e）显影:将胶板效人显影液中，在摇床上30名显影；定影：待条带清晰后，将胶板放入固定液中定影5min；f
g）漂洗：用蒸馏水漂洗胶板10s。9.4.2毛细管电泳荧光检测
9.4.2.1样品准备
将5'FAM荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，HEX荧光标记的PCR产物稀释15倍，TAMRA荧光标记的PCR产物稀释10倍，ROX荧光标记的PCR产物稀释5倍。分别取等体积的上述4种稀释后PCR产物泥合，从混合液中吸取1L加入到DNA分析仪专用深孔板孔中：在板中各孔分别加人0.1LLIZ500分子量内标和8.9μL去离子酷。将样品在PCR仪上95℃变性5min.迅速取出置于碎冰」冷却10min。瞬时离心10s后上机电泳。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括2个～3个参照品种的扩增产物。注：不同荧光标记的扩增产物的最泛烯释倍数最好通过毛细管自泳荧光检谢预试验确定。9.4.2.2开机准备
打万DNA分析仪，检查仪器工作状态，史换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置放丁样品架基座上。打开数据收集软作。
9.4.2.3编板
按照仪器操作程序.创建电泳板，输人电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输人样品编号或名称．
9.4.2.4运行程序
iiiKAoNhiKAca
NY/T 2478—2013
启动运行程序，DNA分析仪自动收集记录毛细管电泳数据。10等位变异数据采集
10.1数据表示
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示，10.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测将待测样品某·位点扩增片段的带型和移动位置与对应的参照品种进行比较.与待测样品扩增片段带型和移动位置相同的参照品种的片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异人小。10.3毛细管电泳荧光检测
使用DVA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异人小数据。通过使用参照品种.消除不同号INA分析仪间可能存在的系统误差。比较参照品种的等位变异大小数据与附录C中的相应数据。两者的差数为系统误差的大小。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差，获得的数据即为待测样品的等位变异大小。10.4结果记录bzxz.net
纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X,Y分别为该位点上两个不同的等位变异，小片段数据在前，大片段数册在后：无效等位变异的大小记录为0/0。示例1：
--个品种的一个SSIK位点为纯合位点.等位变异大小为120bp，则该品种在该位点上的等位变异数据记录为120120。
示例2：
一个品种的-个SSR位点为杂合位点.两个等位变异大小分别为120 bp和126 bp.则该品种在该位点上的等位变异数据记录为120/126。
11判定方法
用附录C中引物进行检测，将获得的待测品种等位变异数据进行品种间比较或与数据库中品种比较.判定方法如下，
a）品种问相似度≤90%.判定为不同品种；b）品种间相似度为90%品种相似度(S)按式(1)计算，
武中：
S 一相似度,单位为百分率(%);
N.—品种i和；之间共同的等位变异数目；N；—品种i中出现的等位变异数月;N，—品种了中山现的等位变异数目。对了11b)和11c)情况，按照GB/T19557.1和GB/T19557.1的规定进行出间鉴定。4
A.1主要仪器设备
A.1.1高压火菌锅。
A.1.2PCR扩增仪
A.1.3电泳槽及配套的制胶附件。A.1.4高压电泳仪。
A. 1. 5 DNA 分析仪。
A.1.6台式高速离心机，
A.1.7凝胶成像系统或紫外透射仪。A.1.8水浴锅。
A.1.9制冰机。
0紫外分光光度计。
A.1.11微量移液器。
2水平摇床。
3胶片观察灯。
A.1.14电-于天平(精确到0.01g)。A.1.15酸度计。
A.2试剂
附录A
【规范性附录】
仪器设备及试剂
除非另有说明.在分析中均使用分析纯试剂。A.2. 1 乙二胺四Z酸二钠(EDTA)。三羟甲基氨基烷(Tris)）
A.2.3浓盐酸。
A.2.4氢氧化钠。
A.2.5去离子中酰胺。
A.2.6溴酚蓝。
A.2.7 二甲苯青。
A.2.8氯伤。
A.2.9异戊醇。
A.2.10甲艾双丙烯酰胺。
A.2.11丙烯酰胺。
A.2.12硼酸，
A.2. 13 尿素。
iiKAoNiKAca
NY/T 2478—2013
NY/T 2478-2013
亲和硅烷。
剥离硅烷，
二甲基一氯硅烷。
A.2.17无水乙醇。
A.2、18四甲基乙二胺(IEMEI))。A.2. 19
过硫酸铵（APS)。
A.2.20冰醋酸。
硝酸银。
2甲醛、
3十六烷基三乙基漠化铵(CTAB)
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，
缓冲液（不含Mg\-）。
四种脱氧核苷酸（dVIPs）
A.2.27Tag DNA娠合酶，
SSR引物。
去离子水，
A.2.30LIZ-500分子量内标。
A.2.31DNA分析仪用内烯酰胺胶液A. 2. 32
2DNA分析仪用光谱校准基质，包括6-FAM、TAMRA,HEX和ROX4种荧光标记的INA片段。
3DNA分析仪专用电泳缓冲液。
B.1IDNA提取溶液的配制
DNA提取溶液的配置便用超纯水。B.1.11mol/L氢氧化钠溶液
附录B
（规范性附录）
溶液配制
称取40.C氢氧化钠，溶于800mL水中，冷郊至案温，定容至1000m。B.1.20.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0)NY/T2478—2013
称取186.1乙二胺四乙酸钠盐.加人800mL水再加人20g氢氧化钠，搅拌，待乙二胺四乙酸二钠盐完全溶解后，冷却至室温。再用氢氧化钠溶液（1mal/L)准确调pH至8.0，定容至1000ml，在103.4kPa（121）条件下火菌20min。B. 1. 30. 5 mol/L 盐酸(HCI)溶液量取25ml浓盐酸置子容量瓶中.加水定容至500mlB.1.41mol/L三羟甲基氨氢基甲烷盐酸溶液(pH8.0)称取6C.55Tris碱溶十约400ml.水中.加盐酸溶液（0.5mal/I.）调pH至8.0.水定容至500mL.在1C3.1kPa(121℃）条件下火菌20min。B.1.52%(W/V)十六烷基三甲基溴化铵(2×CTAB)溶液分别称取20g十六烷基三甲基澳化铵、81.816g氯化钠和20g聚乙烯吡咯烷酮辫于约700ml.水41.加人1C0ml三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（1mal/LpH8.0)和4CmL乙：胺四乙酸二钠溶液（0.5moi/L,H8,0),水定容至 1000 mLB.1.65mul/LNaCl溶液
称取292.2g氯化钠，加入750mI.水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，加水定容至1000nl在103.4kPa灭菌20ming
B.2PCR扩增溶液的配制
PCR扩增相关溶液的配制使用超纯水。B.2. 1 SSR 引物稀释
开盖前瞬时离心1C8.按说明书分别配制前引物利后引物终浓度均100mmo!/1的储存液，务取10证混合.加80ul.水定容至终浓度各10mol/L的L作液B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制变性聚内烯酰胺凝胶电泳相关溶液的配制仪用超纯水。B.3.140%(W/V)丙烯酰胺溶液
分别称取190g丙烯配胺和10g甲叉双丙烯酰胺溶于约400mL水中.加水定容至5001mL.置丁棕色瓶中4%储存。
B. 3. 26. 0 % 变性 PAGE 胶
称取42g尿素溶于约60rL.水中，分别加人10mL10×TBE缓冲液、15ml.10%内烯酰胺溶液、iiiKAoNiiKAca
NY/T2478—2013
150L10%过硫酸铵（新解配制)和50u1.四甲基乙二胺加水定容至【0Gml.B.3.3亲和硅烷工作液
吸取1nl.无水乙醇.加人10μ亲和硅烷和10I.冰醋酸.混匀。B.3.4剥离硅烷工作液
量取2 mL的二甲基二氯硅烷,加8 mL的二氯印烷·混勾。B.3.510%过硫酸铵溶液
称取0.1过硫酸铵济于1mL水中。B.3.610×TBE缓冲液
分别称取108g三羟甲基氨基甲烷和55g硼酸溶于约800ml.水小，加入37ml.乙二胺四乙酸一钠液(0.5 mol/L),加水定容至1000 mLB.3.71×TBE缓冲液
量取500mL的10×TBE缓冲液，加水定容至5000ml.。B.3.86×加样缓冲液
分别称取0.125溴酚蓝和0.125g二甲本青，置于烧杯中，加人49ml.去离子甲酰胺和1mL乙胺四乙酸二钠溶液(0.5I1o1/L.pH8.0).搅拌混勺。B.4银染溶液的配制
银染溶液的配置使用蒸馏水。
B.4.1固定液
量取100mL冰醋酸、加水定容至1000ml。B.4.2染色液
称取ig硝酸银,溶于1000 ml水巾。B.4.3显影液
称取10g氢氧化钠溶于1000ml.水中.用前加2ml.甲醛8
核心引物（35对)见表（.1
110307
N292b1
Hil2c02
连锁群
正尚引物：
附录C
【规范性附录】
核心引物
表 C. 1 核心引物(35对)
引物序列(5'→3\)
CAAATCAATG'AAAA( TY:TCA
反向引物：
GKT'TIKCATGATTTTA
正向引物：
CCGIGATGACAAAGTGLAIGA
反尚引物：
ATGAGTTTGATGCCCTIGGA
正向引物：
CCTICGTTATCTTCTIGCATT
反向引物：
GAGTTAAGAATAAGAGAAGRGG
正问引物：
GCAATGGCGTTLTAGGATTC
反向引物：
GTI'ICACCAACAGTGGGACAAG
S'TAMRA
iiKAoNhiKAca
NY/T2478—2013
退火温度，等位变异
秦脱品独代码
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