NY/T 2678-2015 马铃薯6种病毒的检测 RT-PCR法 NY/T2678-2015 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T26782015
马铃薯6种病毒的检测
RT-PCR法
Detection of the six potato viruses-RT-PCR method2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照（GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标推出农业部种植业管理司提出非归门，NY/T2678—2015
本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（恰尔滨）湖南农业大学园艺学院、华中农业大学生命科学技术学院福建表林大学。本标准主要起草人：张威，艳菊、李学湛、柳俊、詹家绥、碧华、胡新喜、何长征、高艳玲，范国权、中宇,张括、晓丹、T文重、魏琪、邱彩玲、耿宏伟,董学志、万书明。1范围
马铃薯6种病毒的检测RTPCR法
NY/T 2678—20 15
本标准规定马铃警S病毒（PotatouirusSIVS)、马铃薯X病毒（FotatnirusX，PVX)、马铃薯M病毒(PotatovirusM,PVM)马铃碧Y病毒（PotatoznirusY,PVY)、马饸薯卷叶病毒（PututuleurollvirusPLRV)和马铃薯A病毒（PotatovirusA，PVA）的反转录聚合酶链式反成（RT-PCR)分子生物学检测方法（见附录A)，
本标准适用」马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯块茎、植株等组织中病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件：仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包猛所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
本标准采用反转录一案合酶链式反应(reverse-tranacription polymcrase chain Traction,RT-PCR)方法检测马铃薯病毒。其源理是，将RNA的反转录(RT)和cLNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术，RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA.再以cDNA为模板，在TaqDNA案合酶的作用下进行[CR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是净含有月的片段，从而达到鉴定病毒的目的。4试剂和材料
以下所有试剂，除非另有规定仅使用分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。4.1TRIzolRVA提取试剂
4.2三氯甲烷
4.3异丙醇
4.475%乙醇
量取无水乙醇75ml，加水定容至100mL4.5M-MLV反转录酶200U/L)
4. 6RNA 酶抑制剂(40 U/L)
4.7TagDNA聚合酶（5U/L)
4. 8 10× PCR buffer(Mg2+ free)4. 9 MgCl2(25 mmol/L)
4.10dNTP混合物（各2.5mmol/L)4.11焦碳酸二乙酯[DEPC)处理水在100ml.水中，圳入焦碳酸二乙酯（DEPC)50L，室温过夜，121℃高温灭菌20min.分装到1.5 mI. DEPC处理过的离心管中4.1210×TAE电泳缓冲液
羟基甲基氨基甲烷(Iris)242g，冰乙酸57.1mL，乙二胺四乙酸一钠·2I1.37.2g、用氢氧化钠调pH至8.5.加水定容至1000mL。
NY/T2678—2015
4.131×TAE电漾缓冲液
量取10×TAE电泳缓冲（4.12)?00mL.加水定容至1c00nL4.14溴化乙锭溶液（10mg/1）
称取溴化之锭200mg，加水溶解，定容至20tnL。4.151.5%琼脂糖凝胶板
称取琼脂耕1.5-加人1×TAE电泳缓冲液（1.13)定容至100mL，微波炉中加热至琼脂糖融化，待溶液冷却至50℃~60℃时-耐澳化乙锭溶液（4.14）5±I，摇勾.倒人制胶板中均勺铺板-凝固后取下梳子，备用。
4.16引物缓冲液
而DFPC水将上，下游物分别配制成浓度为10G/的水溶液。4.17100bpDNA分子量标准物
4.18阳性对照
参见附录 B中 B. 1 c
4. 19 阴性对照
参见附录B中B.2.
5主要仪器
5. 1 PCR 仪
5.2台式低温高速离心机。
5.3电泳仪、水平电泳槽。
5. 4凝胶成像仪。
5. 5微量移液器(0.51.~~10 1.10 1.~100 [.20 L200 L、100 L-~1 000 L)5.6灭菌锅等。
操作步骤
6.1对照的设立
实验分别设立阳性对照阴性对照和空白对照（即用等体积的DEPC水代替模板RVA做空白对照），在检测过程要同待测样品一同进行始下操作，6.2样品制备
取马铃薯试管苗、块茎芽龈及周围组织或鉴叶组织0.050.1，现用现取或4℃条件下保存，最多存放3山
6. 3 RNA 提取
将样品置于研钵中.加液氮研磨成粉未，转至1.5ml.离心管，加人1mlTRIzol混匀.使其充分裂解；4℃14000g离心5mim；取上清，加入200μl.—氯烷：振荡混匀.室温放置15min：4℃12000g离心15min；吸取上层水相至新1.51nL离心管中，加人0.5ml.异内醇，混匀，室温放置10min；4℃12000g离心10min;充上清.留沥淀，加入1ml.75%乙醇，温利振荡离心管.总浮沉淀：4℃75c0g离心5 min,弃L清.将离心管倒置于滤纸 F，白然燥：川人25μL～100 μL DEIC水溶解淀-即得到RNA。
6.4单重RT-PCR
6.4.1反转录
6.4.1.1反转录引物
-iiiK wcutKAca
NY/T2678—2015
PVS(H附录C中PVS的第1对引[物）、PVX,PVM、PVY、PLRV或PVA病毒的特异性下游引物「也可以用随机引物或oligodT但不适用于PI.RV，只能用于其他5种病每），6.4.1.2RNA预变性
取2.5uLRNA.65℃8min.RNA冰上放置2min;6. 4. 1. 3 反转录反应体系
加人0.5uI.下游引物，反转录反应程序和反应体系中其他成分按照反转录酶说明1，混合物瞬时离心：使试剂沉降到PCR管底。反转录反应后取出直接进行『CR或置一20℃保存。6.4.2PCR扩增
6.4.2. 1 PCR 扩增引物
、下游[物为PVS(J附录中PVS的第1对引物）、PVX,PVM、PVY、PLKV或PVA病毒的特异性引物（见附录C)。
6. 4. 2. 2 PCR 反应体系
按表1顺序加人试剂，混勺，瞬时离心，使液休都沉降到PCR管底，表 1 PCR 扩增反应体系
试剂名称
DEPC水
反转录产物
E游引物
下游引物
10XPCR缓冲液
Tag酶
6.4.2.3PCR反应程序
92%预变性5min;92℃变性30s,55.5%℃退火30s,72%：延伸45$,循环30次：72%延伸8min6.5多重 RT-PCR
采用双重和重RT-PCR检测PVS、PVX、PVM、PVY、PI.RV和PVA病毒。应用固定的组合双重RT-PCR病毒组合:PVY+PIRV、PVMIPVS、PVXIPVA；三重RT-FCR病毒组合：FVY1PVS+PI.RV.PVX+PVM+PVA.
6. 5. 1 反转录
执行双重RT-PCR的反转录时，每种病毒下游引物加0.5uI.DFPC水减少0.5uI.:执行三重RT-PCR的反转录时，每种病毒下游物加0.5L，DEPC水减少1.0L，其他操作参照6.4.16. 5. 2PCR 扩增
执行双重PCR时，每种病毒上、下游物各加0.5μI,DEPC水加人15.5L；执行三重CR时，每种病毒上，下游引物各加0. 5uL,DEPC水加入 14. 5μL,其他操作参照 6. 1.2。6.6PCR产物的电泳检测
在电泳中加入1×TAF电泳缓冲液，使液雨刚刚超过琼脂糖凝胶板。取5l.PCR产物分别和2加样缓冲液混合后，加人到琼脂糖凝胶板的加样孔中，以5100bDNA分子量标准物为参照物在恒压（120V-~150V）卜电泳20min~30min,将凝胶放到凝胶成像系统上观察结果，7结果
7.1试验成立的条件
NY/T 2678—2015
阳性对照的扩增产物检测到预期人小的特异性条带.阴性对照利空白对照的扩增产物均没有检测到预期人小的1的条书。阴性、附性和穿对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。检测结果判定图参见附录D
7.2阳性判定
待检样品如果在729bp.711bp.520bp、447bp.336hp或273bp对应位置出现特性条带，则判定样品为PVS、PVX、PVM、IVY、IPLRV或PVA病毒阴性：如果在729bp对应位置没有山现特导性条带，再用引物PVS-F1，PVSR1对样品进一步扩增，如果在602bp对应位置出现特异性条带则判断样品为 PVS病毒阳性。
7.3阴性判定
如果相应病毒电泳谱情没有扩增到预期大小的特异性条带，则判定样品为该病毒阴性。4
-iiiKwcutKAca
下列缩略语适用于本文件。
A.1PVS,马铃薯S病(PotatouirusS）。附录 A
(规范性附录)
缩略语
A.2IVX铃薯X病毒(Potutovirus X)。A3PVM.马铃薯M病毒（PotatuuirusM）。A.4PVY马铃薯Y病毒(PotatovirusY)。A.5Pl.RV：马铃薯卷叶病毒（Potatoleaf-rull wirus）A.6PVA:马铃薯A病毒（PotatovirusA）。A.7DEPC：焦碳酸-乙(diethylpyrocarbonate)。A.8dNTP：脱氧核苷磷酸(deoxy-rihonucleaside triphosphate)。A.9EB:溴化乙锭(ethidium brornide)。NY/T2678—2015
M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（moloney murine leukermia virus reversetranA.10
scriptase)
A11PCR：合酶链式反应(polytncrasechainrcaction）。A.12RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)。3RTPCR：反转录一聚合嗨链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainrcaction）。A.13
A.14TaqDNA聚合酶：水生栖热菌DNA聚合酶（TaqTNApolymcrase)。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)。A.15
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B. 1 阳性对照
B.1.1毒源的鉴定
附录B
(资料性附录）
阳性和阴性对照参考制备方法
经检测足PVS、PVX、PVM,PVY、PLRV或PVA病毒的样品：.再进行测序，与Genhank中相应病毒的序列进行同源性比对，确定为此神病奔。B.1.2毒源接种指示植物扩繁
再将源接种创相应的指示植物：PVX接种到心叶烟（NicorianaGlutinastz）上，PVY接利到黄榆烟（Nicotianatubacum）上，PVS接种到德莫尼烟（NicotinanaRebneyi）上，PIRV接种到H花刺果曼陀罗（Patastramniun）上：PVM接种到番（Lycupersiconescutenum）上，PVA接种到黄花烟（NicotiaaRustica）上，定期进行检测，当病毒达到高峰期时采收叶片，存放一7o℃冰箱保存备用）B.1.3定期进行检测
6个月后对保存的叶片定期进行检测.以保证R下-FR捡测中阳性对照的有效性。B.2阴性对照
B.2.1样品的鉴定
经检测无PVS.IVX、PVM.PVY、PLRV或PVA病毒的样品，存放-70%冰箱保存备用。B.2.2定期进行检测
1年后对保存的样品定期进行检测，以保证RTPCR捡测中阴性对照的有效性6
-iiiKwcutKAca
病毒引物序列见表C.1，
病毒名称
引物名称
PLRV-R
注1:F代表每种病毒的上游引物。注2:尺代变每种病的下游引物。FVS\和PVS株系。
PVSFAP株系，
附泉C
(规范性附录)
病薄引物序列
表C1病毒引物序列
引物序列(5°~-3')
GAGGGTATGGIGGAGCAGAG
AATCTCAGGCCAAGCATCC
TCTCCTTTGAGATAGGTAGG
CAGCCTTTCATTTCTGTTAG
ATGTCAGCACCAGCTAGCA
TGGIGGIGGTAGAGIGACAA
ACATCTGAGGACATGATGCGC
TGAGCTCGGGACCATTCATAC
GGGATAOGGACATAGGAGAAACT
CTCTTTGTGTTCTOCTCTTGIYT
CGXHTAAAGAGTTCAGCC
GCAATGGGGGTCCAACTCAT
GATGTCGATITAGGTACTGCTG
TCCATTCTCAAIGCACCAIAC
NY/T 2678—2015
PCR 扩增片段长度
NY/T2678—2015
D.1单重RT-PCR检测体系建立
见图D.1。
附录D
（资料性附录）
检测结果判定图
ESEARCH CENTE
6种病毒单重RT-PCR电泳图
D.2PVY和PI
RT-PCR
检测体
见图D.2
空白对照
阴性对照；
PVY+PLRV
PVY和PLRV双重RT-PCR检测体系建立图D.2
D.3PVM和PVS双重RT-PCR检测体系建立见图D.3。
-iiiK wcutKAca
说明：
-loobpMarker;
空自对照：
阴性对照；
4—PVS;
PVM+PVS
PVM和PVS双重RT-PCR检测体系建立PVA和PVX双重RT-PCR检测体系建立D.4
见图D.4。
说明：
100bpMarker:
空白对照：
阴性对照：
PVA+PVX
PVA和PVX双重RT-PCR检测体系建立图D.4
D.5PVY、PLRV和PVS三重RT-PCR检测体系建立见图D.5。
说明：
10obpMarker:Www.bzxZ.net
空白对照：
阴性对照：
-PVS+PLRV:
-PVS+PVY:
PVS+PVY-PLRV
PVY、PLRV和PVS三重RT-PCR检测体系建立NY/T2678—2015
NY/T2678—2015
D.6PVX、PVM和PVA三重RT-PCR检测体系建立见图D.6。
500 bp
说明，
-100 bp Marker:
空白对照：
阴性对照：
-PVX+PVA:
PVX+PVM;
PVX+PVM+PVA
PVX、PVM和PVA三重RT-PCR检测体系建立-iiiKwcutKAca
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