NY/T 2695-2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 NY/T2695-2015 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2695-—2015
牛遗传缺陷基因检测技术规程
Code of practice for molecular detecting for genetic defects incattle
2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国奋牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归I本标准起草单位：全国畜牧总站，中国农业科学院北京奋牧兽医研究所。NY/T 2695—2015
本标准主要起草人：刘丑牛、刘刚、朱化彬、韩地、峭、冯海永、赵俊金、羔飞、邱小田。1范围
牛遗传缺陷基因检测技术规程
本标准规定了牛遗传缺陷基因的检测方法和结果判定。NY/T 2695---20 15
本标准适用于奶牛和肉牛白细胞黏附缺陷症、瓜氨酸血症、牛尿骨酸合酶缺恶症、牛脊雄畸形综合征、牛凝血闪子刘缺乏症、牛并趾征、牛蜘蛛腿综合征基因的检测、2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不所少的。凡是注日期的引用文件，仅注月期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T25887奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法GE/T27642-2011牛个体及亲子鉴微卫星DNA法GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范NY/T1670—2008猪雌激素受体和1卵泡刺激素B亚基单倍体型检测技术规程SV/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SV/T2497、15进出口危险化学品安全试验方法第15部分：PCR-SSCP实验3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
遇传缺陷geneticdefects
家畜生殖细胞或受精卵中的遗传物质在结构或功能上发生了改变、从而使发育个体表现缺陷，具有垂直遗传和终牛性特征。
单基因遗传缺陷monogeric genetic defects单个基因变异而引起的遗传缺陷，其遗传方式符合孟德尔遗传定律。3.3
牛白细胞黏附缺陷症bovineleukocyteadhesiondeficicncy，BLAD由嗜中性粒细胞表面糖蛋H细胞黏附分子整合素的32亚单位基因（D18(β-2integrinsubunit，alsocalledCDI8)第2外显子第55位碱基发牛(A-→+G)突变引[起的--种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为重复性感染，异镜肿胀，颌下淋巴结肿大，常发生门腔、占和肠道黏膜溃疡、并导致早期死亡。3.4
瓜氨酸血症citrullinemia,CN
由精氨酸晓珀酸合酶基因AS.s(argitinasuccinalesynthase）的第5外显子第256位碱基发生（-→I)突变引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为犊牛第1d~第2d出现精神郁、步态紊乱、惊、失明等。
牛脊椎畸形综合征conplexvertebralmalfornation，CvM由编码UDP-N-乙配葡糖胺载体的基因SIL.C35.A3(solutecarrierfamily35mcmbcrA3）的第4外1
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显子第73 位碱基突变(G→T)引起的种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状表现为还胎或胎儿死亡。或物脊椎弯而將骨畸形心脏畸、领知、两前腿筋避缩等。3.6
牛尿苷酸合酶缺乏症deficiency of uridinemonophuphatesynthase，DUMPs由尿苷酸合酶基WMPs（uriclinc:nanaphophat.synthase）的C冰端4处的密码子存在一个点窦变导致密码广（GA转变为终止于TGA引起的一种牛隐性遗传缺陷，其典型临床症状为胚胎或胎儿期死亡,死亡率达100%：
牛凝血因子刘缺乏症factor deficiency,F 凝而卧基因F针（fartor外显12插人了一个小为shp的片段引起的一种牛隐性遗传缺陷，其典型嗮症状为王携带者一般不表现症状：部分携带者和纯合个体表现紊、造成犊牛成活率降低和繁殖性能下降以及免疫力降低。3.8
牛并趾征syndactyly
牛骤蹄症mulefunt，MF
Hi低密度脂蛋白受体结合蛋白基闪LPR4（lowdensitylipoprotcinItceplorrelalerlprotein4)第33外显子发生了两个碱基的突变（C4863A，（4864T)引起一种牛遗传缺陷。其典型临床症状为在不同品种中杂合个体衣现不同的外显率，缺陷个休一般-只多只蹄子均可表现骤蹄。牛骤蹄症个体行走不稳.生产性能下静。
牛蜘蛛腿综合征spiderleg of arachnonelia and arthrogryposis, syndrone of arachnomelia and ar-thgryposis, SAA; arachnomelia syndrome, AS在端十褐牛中由SOLX（sulfite(xitlase）基因第4外显子第363位斯人-个碱基（c.363-364insG）而引起，在西门塔尔牛中由MxCS1（molyhdenumcolactorsynthesisstep1）基因位丁第11外显子第1221~-1225位CA两个碱其的缺失而引起的一种隐性遗传缺陷。其典型临床症状为在瑞.1:褐牛和西门塔尔牛中出现，AS个体表现为牧牛先天性骨骼畸形、体重较轻，造成死胎或出生后不久死亡。3.10
系谱pedigrce
在调查某种遗传病畜离各个个体的发病情况后，采用特定的符号和格式绘制成反映该样体各个个体机马关系和发病情况的图解：4原理
4.1牛白细胞黏附缺陷症的检测
利HCD18基因的DNA序列特异性引物.扩增CE>18基因片段.采用PCRSSCP或PCR-RFLP方法确定个体基型。
4.2瓜氢酸血症的检测
利用ASS苯闪的1)NA序列特升性川物，扩增ASS基因片段，采用PCR·SSCP或PCR-RFLF方法确定个体基因型。
4.3牛脊椎畸形综合征的检测
利用SLC35A3基因的DNA序列特异性引物.扩增SL(35A3基因片段：采用PCR-SSCP或错配PCR突变分析确定个体基因型。
4.4牛尿苷酸合酶缺乏症的检测
-iiiKwcutKAca
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利用尿并酸合酶基因的DNA特异性引物.增尿书酸合酶因片段，采用PCR-RFLP方法确定个体基国型，
4.5牛凝血因子X缺乏症的检测
利用凝面因广X缺乏症FXI基因特异性引物扩增.采用PCR检测确定个体基内型。4.6牛并趾征的检测
利用IL.PR1基风DNA序列设计引物进行扩增，采用测序方法确定个体基因型，4.7牛蜘蛛腿综合征的检测
利用SOUX基因或MOC.S1基因TNA序列设计引物进行扩增.采用测序的方法确定个体基因型，5仪器设备及试剂
5.1仪器设备
5.1.1离心机，离心力10000g。
5.1.2紫外间见分光光度计
5.1.3移液器，量程0.1uL1心0μL，5.1.4PCR仪，96孔热循环。
5.1.5水半电冰槽.长度31cm。
5.1.6凝胶成像系统，
5.2试剂
5. 2. 1 A「内切酶,
5.2.2A内切酶。
5.2.3Fcn471内切酶。
TaaI内切酶
5.2.5Taq DNA 聚合酶
5.2.6乙醇（ethanol).分桁纯。5.2.7
异丙醇（isopropanal）.分析纯。5.2.82
乙二胺四乙酸一钠(EDTA).分析纯。5.2.9
氯化钠(NaCI)，分析纯。
5.2.10十二烷基硫酸钠（SDS)、分析纯5.2.117鞍.分析纯。
5.2.12溴化乙锭，分析纯。
三(羟基甲基）氨基甲烷(Tris Basc)、分析纯。5.2.14球脂糖（分析纯）。
5.2. 15TrisHCl(pH 6.8):将 12.1 Iris Base溶下80 tnl.蒸馏水中-用浓 HCI将 pH调至 6.8.将体积谢至100mL，高正除菌，空温储存。5.2.16缓冲液：
DNA溶解缓冲液(TE):取5mL 1mol/L TrisHCl Buller(pII=8.0)和 0.5 mol/L EDTAa)
pH=8.C）加人100mL蒸馏水的烧杯中，将溶液定容到500ml.后.高温高压灭菌.室温保存；电泳解缓冲液0×TAE：称取2gTtisHase.37.2gNa:EDTA加人11.烧杯中，然后加h)
800ml.去离子水，充分揽拌溶解，再加人57.1mL醋酸，充分混匀定容至1I.率温保存；c）10×上样缓冲液：用移液器吸取2tnLEDTA（500mmol/L：pH8.0)加人约40ml.蒸馏水中NY/T 2695—2015
再称取250mg没盼蓝.量取50ml.丙一醇，定容至100ml，4℃保存5.2.171%-~3%琼脂糖凝胶：称取1g~3g琼脂糖-加10℃mLTAE清沸，等降至50%.~60℃时.加人识化二锭或真他燃料。
5.2.182%-~5%琼脂凝胶：称取2g-~5g琮脂瓣,加10mLTAE煮沸，等降不50%.~60%℃吋.加人溴化乙锭或其他燃料。
6检测步骤
6.1样品制备
收集牛血液、纠织（耳组织、肌肉、尾组织，皮肤等）带毛囊的毛发或精液等材料，其中Ⅲ液用抗凝剂处理，并4℃短期保存，-℃及以下低温保存备H：组织，带毛囊的毛发浸人75为的酒精，精液，一20℃.及以下低温保存备用。
6.2DNA的提取
按GB/T27642—2011中附录B规定的方法执行：DNA样品操作注意事项按SN/T1119中规定的方法执行，
6.3引物配制
引物配制按VY/T16702C086.2.1条款的现定执行，物信息参见附录A中A.1。6.4PCR反应
6.4.1PCR反应体系和程序
按附录A中A2的要求配制FCR反应休系，并按A.3的程序进行扩增。PCR燥作中防止污染等注意事项见GA/T383。
6.4.2PCR产物电泳检测
取5ul10μLPCR产物.L样于1%3%琼脂糖凝胶中进行电泳，结果与标准带（marker)比对确定是否为预期扩增片段，如果不是预期扩增片段，重复6.3和6.4步骤，直到确定为预期扩增片段为。
6.5分析方法
6.5.1错配PCR窦变分析
利用牛鼠因组的特异性引物1·3作：为内标引物扩增：重复6.4步骤检测PCR反应产物：利用致病基因的特性扩增引物1-1筛查致病突变·重复6.4步骤检测扩增产物，若存在该条带说明被测个休携带致病基因。
6.5.2 SSCP 分析
按SN/T2497.5规定的方法行
6.5.3RFLP分析
按B.1和B.2的要求配制RFI.P反应体系，在37℃水浴中湿浴4h.然后酶切产物用2.C%~5.0%踪脂糖凝胶电冰检测。观察和记录,并分析个体基因型。6.5.4测序分析
刹用ICR产物测序.分折测序峰图以判定个体毕因型。6.5.5系谱分析
先对某遗传病家留群体的发病情况进行详缩调查，出按一定方式将调查钻果绘成系谱；然后，根摄孟德尔定律对务个体的表现型和基内型进行分析，通过分析可以判断某种遗传学是单基因病或者是多基因病：以及确定单基因病的遗传方式：6.6结果判定
-iiiKwcutKAca
6.6.1牛脊椎畸形综合征(CVM)
NY/T2695—2015
利用PCR-SSCP、PCR-RFLP或错配PCR突变分析(PCR-MAMA)3种方法的结果如下：a) PCR -SSCP:
1）引物1-1(参见附录 A中表 A.7)的PCR扩增产物长度为 177bp,出现2条带(AA)的判定为正常个体;出现3条带或4条带(AB)的判定为隐性基因携带个体;出现2 条传(BB的判定为患病个体。
2）引物1-2(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为249bp.出现2条带（AA)的判定为正常个体；出现3条带或4条带（AB)的判定为隐性基因携带个体；出现2条带（BB)的判定为忠病个体。检测结果判定参见附录 C中图C.1。h）PCR-RFI.P:按GB/T 25887的规定执行.错配PCR突变分析(PCR-MAMA：引物1-3（参见附录A中表A.1)作为内标引物，其产物长度为216bp.物14(参见附录A中表A.1)扩增致病突变，其产物长度为105bp.扩增产物出现216bp1条带，判定为正常个体；扩增产物中同时出现216bp和105bp2条带，判定为隐性基风携带个体；扩增产物出现105bp1条带，判定为患病个体。检测结果判定参见附录（中图 2。
6.6.2牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)利用PCR-SSCP或PCR-RFLP2种方法的结果如下：a）PCR-SSCP：引物2-1(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为187bp.出现2条带(AA)的判定为正常个体；出现3条带(AE)的判定为稳性基因携带个体：出现2条带（BB)的判定为患病个休。检测结果判定参见附录C中图C、3。b)ICR-RFIP:
1）引物2-2(参见附录A中表A.1)扩增产物为136bp条带，出现108bp和28bp2条带的为AA基内型，判定为正常个体；出现1361p108bp和28p3条带的为AB基因型、判定为隐性基携带者；酶切后出现136b1条带的为BB型，判定为患病个体。检测结果判定参见附录C中图C.4。
2）引物2-3（参见附录A中表A.1)扩增产物为324bp条带，出现193bp和1311ip2条带的为AA基因型，判定为正常个体，山现324bp、193bp和131bp3条带的为AB因型，判定为隐性基因携带若：酶切后出现324bP1条带的为BB型,判定为患病个体，检测结果判定参见附录 C中图 C. 5.
6.6.3瓜氨酸血症(CN)
利用PCR-SSC或PCR-RFEP2种方法的结果如I下：l）PCR-SS(江:引物3-1(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为177bp,出现2条带（AA)的判定为正常个体：出现3条带（AB)的判定为隐性基因携带个体；出现2条书（BB)的判定为患病个体。检测结果判定参见附录C中图C.6。b) PCR-RFLP:
1）引物3-2(参见附录A中衣A.1)扩增产物为199bp条带，出现103bp和82bp2条带的为AA基因型.判定为正常个休；出现185bp、103bp和82bp3条带的为AB因型，判定为隐性携带个体；出现199bp1条带的为T3乃基因型、判定为患病个休。检测结果判定参见附录C中图C.7，
引物3-3参见附录A中表A.1)折增产物为282bp条带出现191bp和88bp2条非的2
为AA基内型，判定为正常个体：出现282bp,194bp和88bp3条带的为AB基因型，判定为隐性携带个体：出现2821op1条带的为1315型。检测结果判定渗见附录C中图C.8.6. 6.4牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）NY/T2695-2015
利用ICR-RFIP方法的结果如下：引物1(参见附录A表A.1)扩增产物为108bp条带.出现53bp.36bp和19hp3条带的为八A因型.判定为正常个体;山现89hp.53bp.36hp和t9bm1条带为AB基因型·判定为隐性携带个体;酶切后出现89bp和:9bp 2条带的为型,判定为忠病个体，检测结果判定参见附录C中图C9.
6.6.5牛凝血因子缺乏症（F）
利用PCR乃法的结果如下：引物5(参见附录Afr表A.1)扩增产物出现211bp条带,判定为正常个体；扩增产物出现21h>和320bp条作.判定为携带个体；扩增产物出现320bp条带的为患病个体。检测结果判定参死附录（中图（106.6.6蜘蛛腿综合征(AS)
利测序方法的结果如下：
引物6-1(参见附录A中表A.1)扩增SOLX基固物为446hp条带。护增产物经IVA测a
序,AS363 位置上(第4外显子,上)碱基为 C,判定为正常个体:DNA图中在 363 位臀L碱基G/C.判定为携带杂合子个体：363位置为碱本为G.判定为患病个体。检测结果判定参死晰录c中图,
b) 引物 6-2 和引物 6-3(参见附录 A中表 A. 1)布间体系扩增 M()S(1 基因产物为 208 bp条带（野生型)和142bp（突变型）条带：扩增物经DNA测序，AS12241225位置（第11外品子上)碱基为CA,则判定为E常个体：扩增严物经DNA测序，AS1224～1225位置1（第1)外显子.1)基缺火为C或A，则判定为隐性基因携带个体；护增产物经DNVA測序，AS1224-1225位置L(第11外显子[.)碱其缺火为（A,测判定为患病个体。检测结果判定参见附录C中图.12。
6.6.7牛并趾征(MF)
利用测序方法的结果如下：物7（参见附录A中表A.1)扩增产物为580h条作，扩增产物经DNA测序，LRP4基因第33外显子LPR11863～1864位置上为CG，判定为正常个体：扩增产物为580bp条带。扩增产物经DNA测序.LRP4基闪第33外显子LPR44863-4864位置上为（或A和G或T，判定为陀性其因携个休：扩增产物经DNA测序，LRP4基因第33外显子.PR44863~4864位置I为AT.判症为忠病个体。检测结果判定参见附录C中图C13，同时结合系谱分析验证测序结果：参见附录 C中图 C. 14。
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(蒋）
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A.2PCR反应体系和反应程序
A. 2. 1 PCR 反应体系
PCR 反应体系见表 A, 2 .
PCR Ruffer(10X)
Tag (s U/)
Frimer - F(10 pmol/ μL)
Priner:R(lO pmol/μL)
表 A. 2『CR反应体系
模板 DNA(50 ng/μL-100 ng /μL)a0
总体积
注:HCR反应体系可以根据实际情况而调整。A, 2. 2 PCR 反应程序
PCR反应程序见表A.3
表 A. 3PCR反应程序
预变性
注：具体退火湿度参照表A.1、
35个循环
51℃~-66℃
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单倍反应体系.pl.
最后延伸
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酶切反应体系
酶切反成体系见表B.1。
FCR产-物
10X缓补液
限制性酶内切酶
总体积
附录Ｒ
（规范性附录】
酶切反应体系及内切酶信息
表B.1酶切反应体系
注：班动反应体系可以据实际情况而调整内切酶信息
引物对应内切酶见表B.2、
引物对应内切酶信息
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引物2-3
引物3-2
引物3-3
-iiK wcut KAca
单借反成体系-.
内划酶
TagT酶
Tagl酶
B3cu471梅
AeI嗨
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