GB∕T 15670.20-2017
基本信息
标准号： GB∕T 15670.20-2017
中文名称：农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 农药 登记 试验 方法 体外 哺乳动物 细胞 基因突变
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标准简介
GB∕T 15670.20-2017 农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
GB∕T15670.20-2017
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标准内容
ICS65.100
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.20—2017
农药登记毒理学试验方法
第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 20:In vitro mammalian cell gene mutation test2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：
第2部分：急性经口性试验
霍恩氏法：
第3部分：急性经口毒性试验
序贯法；
第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验：
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验：第13部分：业慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.20—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第20部分。本部分按照GB/T11一2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江。1
1范围
农药登记毒理学试验方法
第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
GB/T15670.20—2017
GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T15670.14—2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
forwardmutation
正向突变
野生型基因经过突变成为突变型基因的过程，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。3.2
碱基置换型致突变物basepairsubstitutionmutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质3.3
移码型致突变物frameshiftmutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。3.4
表型表达时间phenotypicexpressiontime新突变的细胞耗尽改变的基因产物所需的时间。3.5
mutantfrequency
突变频率
所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。4试验目的
本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性，1
TYKAONIKAca
GB/T15670.20—2017
5试验概述
本试验属正向突变试验，可检出碱基置换型致突变物和移码型致突变物。在加人和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞传代培养。胸苷激酶水平正常的细胞对三氟胸替（trifluorothvmidine，TFT）等敏感，因面在培养液中不能生长分裂，实变细胞则不敏感，在含有三弗胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。相似的，次黄吟鸟嘌呤磷酸核糖基酶（HPRT）正常的细胞对6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG)敏感，突变的细胞则不敏感，在含有6-硫代鸟嘌呤的选择性培养液中可生长形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。6试验方法
6.1受试物和试剂
6.1.1受试物
受试物的配制
固体受试物需溶解或器浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度，液体受试物可以直接加人试验系统，或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则应证实赔存不影响其稳定性。6.1.1.2
溶剂的选择
溶剂应是非致突变物不上
受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。溶性溶剂
6.1.1.3.1
甲基亚砜（IMS0也是常用落剂但使用时依度不应人子0.5受试物浓度设置
最高浓度的选择
首选溶剂是水或水
决定最高农度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality）的改变。
6.1.1.3.2
细胞毒性的确定
应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（totalgrowth）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。6.1.1.3.3剂量设置
至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，通常浓度间隔系数在2~10之间。如最高浓度是基于细胞毒性，则该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相对细胞总生长情况应为10%~20%（不低于10%）对于细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5mL/mL，5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值。最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化。不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。2
-TKAONKAca
6.1.2对照
6.1.2.1一般原则
GB/T15670.20—2017
在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂）对照。6.1.2.2阳性对照
当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质。在没有代谢活化系统时，阳性对照物可使用甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS，HPRT试验）、甲磺酸甲酯（methylmethancsulfonate,MMS,TK试验）基业硝基脉（ethylnitrosourea，ENU，HPRT试验）等。在有代谢活化系统时，可以使用3甲基胆葱（3-methylcholanthrene,HIPRT试验，TK试验）、环磷酰胺（cyclophosphamide，TK试验）、N-亚硝基胍（N-nitroso-dimethylamine，HPRT试验）、7，12-二甲基蕙（HPRT试验）等。
6.1.2.3，阴性对照
也可使用其他适宜的阳性对照物。阴性对照（溶剂对照)除不含受试物外，其他处理应与受试物组相同。当不具有实验室历史资料证
实所用溶剂无致突度作用和无其他有害作用时：应增设空白对照6.1.3细胞
合鼠肺细胞株（V-79和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）。HPRT位点突变分析宜用中国
变分析宜用小鼠淋巴瘤细胞株
体污染的检查。
6.1.4培养液
8Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）TK位点突
在使用前应进行有无支原
应根据试验所用系统和细胞美型来选择适置的培养救，对十V-79或CHO细胞常用MEM(Eagle)培养液如入
%胎面油
加人10%马血清和适量抗菌素。
6.1.5活化系统
Ko细胞，常用RPMI1640培养液
S9是从经酶诱导剂处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备通常使用的是S9混合物（S9mlx
见GB/T15670.142017的5.7。S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）。S9mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix的活性进行监定，应能明显活化阳性对照物。也可使用下述配方：S9
MgClz(o.4mol/L)
KCI(1.65 mol/L)
葡萄糖-6-磷酸
辅酶Ⅱ（氧化型，NADP）
用无血清MEM培养液补足至1mL。6.1.6选择剂
6-硫代鸟嘌呤（6-TG）宜使用终浓度5μg/mL~10ug/mL。三氟胸苷（TFT）宜使用终浓度3μg/mL.
-KAoNiKAca
GB/T15670.20—2017
6.1.7处理培养液（THMG/THG）
为减少细胞的自发突变率，在试验前，先将细胞加在含THMG的培养液中培养24h，杀灭自发的突变细胞，然后将细胞再接种于THG（不含氨甲噗呤的THMG培养液）中培养至对数生长期。THMG含除培养液成分外的各物质终末浓度如下：胸苷
次黄嘌呤
氨甲噪呤
甘氮酸
试验步骤
6.2.1HPRT位点突变分析
6.2.1.1细胞准备
5X10-5mol/L
5×10mol/L
4X10imol/L
1X10-mol/L
试验前1d接种细胞5×105/mL于培养瓶（血）中，置丁37℃孵箱培养24h。6.2.1.2染毒
试验时吸去培养瓶（血）中的培养液，加人一定浓度的受试物、S9mix(不加人S9mix的样品，用培养液补足）及一定量的不含血清培养液，置培养箱中处理3h-~6h后，吸去培养液，用Hank's液洗细胞三次·加入含胎牛血清的培养液继续培养20h。6.2.1.3突变型细胞的表达
在受试物与细胞作用后第1天和第3天将细胞按低密度分种，控制细胞浓度在1×10\/mL以下。培养7d后进行突变体的选择及集落形成率的测定。6.2.1.4细胞毒性测定
在表达的同时，每培养瓶（皿）接种200个细胞，每个剂量组5瓶（皿），于37℃培养7d后，用甲醇固定并用姬姆萨染色，计数每瓶（血）的细胞集落数，计算出每个剂量组的细胞存活率。6.2.1.5突变体的选择及集落形成率的测定表达结束后，消化细胞分别接种，每组3个5个培养瓶（血），每瓶（血）接种2×105个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG（终浓度为5μg/mL），同时取上述消化后的细胞每瓶（血）接种200个，每组5个瓶（血），与上述瓶（皿）同时放入培养箱培养7d，固定后进行染色，计数集落数并分别计算集落数、存活率和突变频率(MF)。
6.2.1.6计算
绝对集落形成率（绝对CFE)按式(1)计算：6.2.1.6.1
绝对CFE
形成集落数，
接种细胞数
2相对集落形成率（相对CFE)按式(2)计算：6.2.1.6.2
相对CFE
6.2.1.6.3
3突变频率（MF）按式（3）计算：4
试验组绝对CFE
溶剂对照组绝对CFE×100%
.（1)
-iiKAoNiKAca
突变型细胞集落数
接种细胞数×绝对集落形成率×100%6.2.2TK位点突变分析（L5178Y细胞，96孔板法）6.2.2.1处理
GB/T15670.20-—2017
·（3）
取生长良好的细胞，调整浓度为5×10/mL，按1%体积加人受试物，37℃振摇处理3h。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养液洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞浓度为2×10°/mL。6.2.2.2PE(0d的平板接种效率）测定取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量作1块～2块板，37℃，5%COz，饱和湿度条件下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。Www.bzxZ.net
6.2.2.3表达
步骤6.2.2.1所得细胞悬液作2d表达培养，每天计数细胞并保持浓度在1X105/mL以下。6.2.2.4PE2（第2天的平板接种效率）测定第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤6.2.2.2作梯度稀释并接种96孔板，培养12d后计数每块平板有集落生长的孔数。6.2.2.5TFT抗性突变频率（MF)测定第2大表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞浓度为1×10/mL，加人TFT（终浓度为3μg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均2000个细胞/孔），每个剂量作2块～4块板，37℃，5%cOz，饱和湿度条件下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。6.2.2.6计算
平板效率按式(4)计算：
6.2.2.6.1
式中：
6.2.2.6.2
6.2.2.6.3
式中：
平板效率：
无集落生长的孔数；
总孔数；
每孔接种细胞数。
PE=-In(EW/TW)
相对存活率(RS)按式(5)计算：
相对存活率（RS)：
突变频率（MF)按式（6)计算：
PEo(处理）×100%
PEo对照）
MF=-In(EW/TW)/n ×10
突变频率；
·（4)
·（5）
-TTKAONTKAca
GB/T15670.20—2017
无集落生长的孔数；
TW—总孔数；
每孔接种细胞数，取值为2000。3统计分析
用适当的显著性检验方法进行统计学处理。7试验结果评价
7.1在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：a）受试物引起突变频率具有统计学意义并与剂量相关的增加；b）受试物在任何一个剂量条件下，引起突变频率具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。阳性结果表明受试物可引起所用哺乳动物细胞的基因突变。可重复的阳性剂量-反应关系意义更大。
7.2不符合以上标准的受试物可认为在本试验系统中无致突变性。阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起所用哺乳动物细胞的基因突变。7.3尽管大多数试验都能得出明确的阳性或阴性结果，但存在即使经过多次重复试验仍无法对受试物活性做出明确判断的个别情况。8试验报告
试验报告至少应包括以下内容：试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。a)
b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况。试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。d)
试验摘要
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）e）
剂型、生产日期（批号）、外观性状、配制所用溶剂和方法。细胞株名称。
试验条件和方法：
1）代谢活化系统：制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方；对照物：阳性对照物名称和使用浓度，阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度；2）
培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度；3）
接种时的细胞浓度以及所用培养瓶（血）的规格；处理时间：受试物与试验系统的接触时间：5）
表达时间；
结果评价方法。
h）试验结果：
受试物最高剂量的确定及结果：包括细胞毒性的测定、溶解情况、对PH和渗透压的影响1)
(如果有影响)；
试验结果：试验组和对照组的突变频率及统计结果；2）
阳性对照组和阴性对照组（包括常用溶剂，如DMSO)在本实验室历史上的突变频率范3）
-TKAONiKAca
围、均值和标准差（说明样品数）GB/T 15670.20—2017
试验结论：给出受试物在试验条件下是否引起体外培养的细胞基因突变的结论，必要时对有关问题进行讨论
原始记录保存情况的说明。
KAONIKAca
GB/T15670.20-2017
中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
GB/T15670.20—2017
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北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
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开本880×12301/16印张0.75字数16下字2017年7月第一版
2017年7月第一次印刷
书号：155066：1-54135
由本社发行中心调换
如有印装差错
版权专有
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举报电话：（010）68510107
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农药登记毒理学试验方法
第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 20:In vitro mammalian cell gene mutation test2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：
第2部分：急性经口性试验
霍恩氏法：
第3部分：急性经口毒性试验
序贯法；
第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；
第6部分：急性吸入毒性试验：
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验；第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验：第13部分：业慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.20—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第20部分。本部分按照GB/T11一2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江。1
1范围
农药登记毒理学试验方法
第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
GB/T15670.20—2017
GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T15670.14—2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
forwardmutation
正向突变
野生型基因经过突变成为突变型基因的过程，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。3.2
碱基置换型致突变物basepairsubstitutionmutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质3.3
移码型致突变物frameshiftmutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。3.4
表型表达时间phenotypicexpressiontime新突变的细胞耗尽改变的基因产物所需的时间。3.5
mutantfrequency
突变频率
所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。4试验目的
本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性，1
TYKAONIKAca
GB/T15670.20—2017
5试验概述
本试验属正向突变试验，可检出碱基置换型致突变物和移码型致突变物。在加人和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞传代培养。胸苷激酶水平正常的细胞对三氟胸替（trifluorothvmidine，TFT）等敏感，因面在培养液中不能生长分裂，实变细胞则不敏感，在含有三弗胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。相似的，次黄吟鸟嘌呤磷酸核糖基酶（HPRT）正常的细胞对6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG)敏感，突变的细胞则不敏感，在含有6-硫代鸟嘌呤的选择性培养液中可生长形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。6试验方法
6.1受试物和试剂
6.1.1受试物
受试物的配制
固体受试物需溶解或器浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度，液体受试物可以直接加人试验系统，或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则应证实赔存不影响其稳定性。6.1.1.2
溶剂的选择
溶剂应是非致突变物不上
受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。溶性溶剂
6.1.1.3.1
甲基亚砜（IMS0也是常用落剂但使用时依度不应人子0.5受试物浓度设置
最高浓度的选择
首选溶剂是水或水
决定最高农度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality）的改变。
6.1.1.3.2
细胞毒性的确定
应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（totalgrowth）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。6.1.1.3.3剂量设置
至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，通常浓度间隔系数在2~10之间。如最高浓度是基于细胞毒性，则该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相对细胞总生长情况应为10%~20%（不低于10%）对于细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5mL/mL，5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值。最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化。不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。2
-TKAONKAca
6.1.2对照
6.1.2.1一般原则
GB/T15670.20—2017
在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂）对照。6.1.2.2阳性对照
当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质。在没有代谢活化系统时，阳性对照物可使用甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS，HPRT试验）、甲磺酸甲酯（methylmethancsulfonate,MMS,TK试验）基业硝基脉（ethylnitrosourea，ENU，HPRT试验）等。在有代谢活化系统时，可以使用3甲基胆葱（3-methylcholanthrene,HIPRT试验，TK试验）、环磷酰胺（cyclophosphamide，TK试验）、N-亚硝基胍（N-nitroso-dimethylamine，HPRT试验）、7，12-二甲基蕙（HPRT试验）等。
6.1.2.3，阴性对照
也可使用其他适宜的阳性对照物。阴性对照（溶剂对照)除不含受试物外，其他处理应与受试物组相同。当不具有实验室历史资料证
实所用溶剂无致突度作用和无其他有害作用时：应增设空白对照6.1.3细胞
合鼠肺细胞株（V-79和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）。HPRT位点突变分析宜用中国
变分析宜用小鼠淋巴瘤细胞株
体污染的检查。
6.1.4培养液
8Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）TK位点突
在使用前应进行有无支原
应根据试验所用系统和细胞美型来选择适置的培养救，对十V-79或CHO细胞常用MEM(Eagle)培养液如入
%胎面油
加人10%马血清和适量抗菌素。
6.1.5活化系统
Ko细胞，常用RPMI1640培养液
S9是从经酶诱导剂处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备通常使用的是S9混合物（S9mlx
见GB/T15670.142017的5.7。S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）。S9mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix的活性进行监定，应能明显活化阳性对照物。也可使用下述配方：S9
MgClz(o.4mol/L)
KCI(1.65 mol/L)
葡萄糖-6-磷酸
辅酶Ⅱ（氧化型，NADP）
用无血清MEM培养液补足至1mL。6.1.6选择剂
6-硫代鸟嘌呤（6-TG）宜使用终浓度5μg/mL~10ug/mL。三氟胸苷（TFT）宜使用终浓度3μg/mL.
-KAoNiKAca
GB/T15670.20—2017
6.1.7处理培养液（THMG/THG）
为减少细胞的自发突变率，在试验前，先将细胞加在含THMG的培养液中培养24h，杀灭自发的突变细胞，然后将细胞再接种于THG（不含氨甲噗呤的THMG培养液）中培养至对数生长期。THMG含除培养液成分外的各物质终末浓度如下：胸苷
次黄嘌呤
氨甲噪呤
甘氮酸
试验步骤
6.2.1HPRT位点突变分析
6.2.1.1细胞准备
5X10-5mol/L
5×10mol/L
4X10imol/L
1X10-mol/L
试验前1d接种细胞5×105/mL于培养瓶（血）中，置丁37℃孵箱培养24h。6.2.1.2染毒
试验时吸去培养瓶（血）中的培养液，加人一定浓度的受试物、S9mix(不加人S9mix的样品，用培养液补足）及一定量的不含血清培养液，置培养箱中处理3h-~6h后，吸去培养液，用Hank's液洗细胞三次·加入含胎牛血清的培养液继续培养20h。6.2.1.3突变型细胞的表达
在受试物与细胞作用后第1天和第3天将细胞按低密度分种，控制细胞浓度在1×10\/mL以下。培养7d后进行突变体的选择及集落形成率的测定。6.2.1.4细胞毒性测定
在表达的同时，每培养瓶（皿）接种200个细胞，每个剂量组5瓶（皿），于37℃培养7d后，用甲醇固定并用姬姆萨染色，计数每瓶（血）的细胞集落数，计算出每个剂量组的细胞存活率。6.2.1.5突变体的选择及集落形成率的测定表达结束后，消化细胞分别接种，每组3个5个培养瓶（血），每瓶（血）接种2×105个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG（终浓度为5μg/mL），同时取上述消化后的细胞每瓶（血）接种200个，每组5个瓶（血），与上述瓶（皿）同时放入培养箱培养7d，固定后进行染色，计数集落数并分别计算集落数、存活率和突变频率(MF)。
6.2.1.6计算
绝对集落形成率（绝对CFE)按式(1)计算：6.2.1.6.1
绝对CFE
形成集落数，
接种细胞数
2相对集落形成率（相对CFE)按式(2)计算：6.2.1.6.2
相对CFE
6.2.1.6.3
3突变频率（MF）按式（3）计算：4
试验组绝对CFE
溶剂对照组绝对CFE×100%
.（1)
-iiKAoNiKAca
突变型细胞集落数
接种细胞数×绝对集落形成率×100%6.2.2TK位点突变分析（L5178Y细胞，96孔板法）6.2.2.1处理
GB/T15670.20-—2017
·（3）
取生长良好的细胞，调整浓度为5×10/mL，按1%体积加人受试物，37℃振摇处理3h。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养液洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞浓度为2×10°/mL。6.2.2.2PE(0d的平板接种效率）测定取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量作1块～2块板，37℃，5%COz，饱和湿度条件下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。Www.bzxZ.net
6.2.2.3表达
步骤6.2.2.1所得细胞悬液作2d表达培养，每天计数细胞并保持浓度在1X105/mL以下。6.2.2.4PE2（第2天的平板接种效率）测定第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤6.2.2.2作梯度稀释并接种96孔板，培养12d后计数每块平板有集落生长的孔数。6.2.2.5TFT抗性突变频率（MF)测定第2大表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞浓度为1×10/mL，加人TFT（终浓度为3μg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均2000个细胞/孔），每个剂量作2块～4块板，37℃，5%cOz，饱和湿度条件下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。6.2.2.6计算
平板效率按式(4)计算：
6.2.2.6.1
式中：
6.2.2.6.2
6.2.2.6.3
式中：
平板效率：
无集落生长的孔数；
总孔数；
每孔接种细胞数。
PE=-In(EW/TW)
相对存活率(RS)按式(5)计算：
相对存活率（RS)：
突变频率（MF)按式（6)计算：
PEo(处理）×100%
PEo对照）
MF=-In(EW/TW)/n ×10
突变频率；
·（4)
·（5）
-TTKAONTKAca
GB/T15670.20—2017
无集落生长的孔数；
TW—总孔数；
每孔接种细胞数，取值为2000。3统计分析
用适当的显著性检验方法进行统计学处理。7试验结果评价
7.1在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：a）受试物引起突变频率具有统计学意义并与剂量相关的增加；b）受试物在任何一个剂量条件下，引起突变频率具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。阳性结果表明受试物可引起所用哺乳动物细胞的基因突变。可重复的阳性剂量-反应关系意义更大。
7.2不符合以上标准的受试物可认为在本试验系统中无致突变性。阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起所用哺乳动物细胞的基因突变。7.3尽管大多数试验都能得出明确的阳性或阴性结果，但存在即使经过多次重复试验仍无法对受试物活性做出明确判断的个别情况。8试验报告
试验报告至少应包括以下内容：试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。a)
b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况。试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。d)
试验摘要
受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）e）
剂型、生产日期（批号）、外观性状、配制所用溶剂和方法。细胞株名称。
试验条件和方法：
1）代谢活化系统：制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方；对照物：阳性对照物名称和使用浓度，阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度；2）
培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度；3）
接种时的细胞浓度以及所用培养瓶（血）的规格；处理时间：受试物与试验系统的接触时间：5）
表达时间；
结果评价方法。
h）试验结果：
受试物最高剂量的确定及结果：包括细胞毒性的测定、溶解情况、对PH和渗透压的影响1)
(如果有影响)；
试验结果：试验组和对照组的突变频率及统计结果；2）
阳性对照组和阴性对照组（包括常用溶剂，如DMSO)在本实验室历史上的突变频率范3）
-TKAONiKAca
围、均值和标准差（说明样品数）GB/T 15670.20—2017
试验结论：给出受试物在试验条件下是否引起体外培养的细胞基因突变的结论，必要时对有关问题进行讨论
原始记录保存情况的说明。
KAONIKAca
GB/T15670.20-2017
中华人民共和国
国家标准
农药登记毒理学试验方法
第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验
GB/T15670.20—2017
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开本880×12301/16印张0.75字数16下字2017年7月第一版
2017年7月第一次印刷
书号：155066：1-54135
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