GB∕T 15670.22-2017
基本信息
标准号： GB∕T 15670.22-2017
中文名称：农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复∕程序外DNA合成试验
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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相关标签： 农药 登记 试验 方法 体外 哺乳动物 细胞 DNA 损害 修复 程序 合成
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标准简介
GB∕T 15670.22-2017 农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复∕程序外DNA合成试验
GB∕T15670.22-2017
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ICS65.100
中华人民共和国国家标准
GB/T15670.22—2017
农药登记毒理学试验方法
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 22:DNA damage and repair/unscheduled DNA synthesis testinmammalian cells invitro
2017-07-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-02-01实施
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
第2部分：急性经口毒性试验
霍恩氏法；
第3部分：急性经口毒性试验
序贯法；
第1部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验：
第6部分：急性吸人毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.22—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第22部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江。1
1范围
农药登记毒理学试验方法
GB/T15670.22—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验
GB/T1567O的本部分规定了体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验的基本原则、方法和要求
本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
程序外DNA合成
unscheduledDNA synthesis;UDS发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成。2.2
净核银粒netnucleargrain；NNG在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（CG)，即NNG=NG一CG。由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养物中的细胞NNG汇总。
3试验目的
该测试系统是通过对DNA修复合成水平的检测来评价受试物能否对原代哺乳动物细胞和已建立的哺乳动物细胞系的DNA造成损伤及损伤的程度。由于UDS反映损伤的切除修复过程，并反映出损伤的程度，因此可作为化学致癌剂短期生物学试验的判断终点。4试验概述
将分离和培养的非S期哺乳动物细胞移人含胸腺嘧啶核苷（\H-TdR)和受试物的培养瓶中，孵育一定时间后，观察H-TdR掺人情况，如果受试物造成了细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA修复，在修复过程中HTdR整合人DNA链中，造成\HI-TdR在修复后DNA中的掺人。再用放射性白显影或液体闪烁计数的方法米观察掺人H-TdR的量，掺入越多，说明受试物对DNA的损伤越广泛。除非采用肝原代细胞作为靶细胞，培养的哺乳动物细胞均要在加和不加外源性代谢活化系统两种情况下与受试物作用。
鉴于原代培养肝细胞存在易于分离培养、保留肝微粒体酶系等优点，建议用原代培养肝细胞作为试验的靶细胞。
TTKAONTKAca
GB/T15670.22—2017
5试剂与器材
5.1试剂
注：全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。5.1.1细胞增殖用培养基
Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）85份，小牛血清15份，加人青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及1c0μg/mL。EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌，4C冰箱贮存。5.1.2同步用培养基
不含精氨酸的Dgle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）98份，小牛血清2份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。5.1.3Hanks平衡盐溶液（HBSS）贮液
将氩化钠
160g、氯化钾8硫酸镁MgS01.0)2g及氯化镁（MgC·6H0)2g溶于800ml双蒸水（50℃
60C中另取无永氯花钙2.8溶手100mL双蒸水中。将上述两溶液混合后，加
000mL.加人氣甲烷mL
贮液B：将磷酸氢二
(KH,PO
.2H20)1.2
钠NHPO,：
保存于
葡萄糖
（或Na
g溶解
g）磷酸二氢钾
mL双蒸水中，加人100mL
0.4%酚红溶液（取酚红1手mL1mol/L氢氧化钠中，待完
全蓉解后加人双蒸水中至25CmL），1000mL，加人二氯电烷2mL，保存于加水至1
贮液C.1.4%碳酸氢钠以双蒸水配CE
应用液的配制：取A液1份B液1份，水民份混合后分装于玻璃容器内，高压灵菌，4C保存。用前加人1.4%碳酸氢钠，将pl1调整至7.27磷酸缓冲液（无钙、镁的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液）（pH7.4）5.1.4
取氯化钠8.C0g、磷酸二氢钾0.20g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠（NHPO：12H,0)2.89g溶于
1000mL双蒸水中。
5.1.50.02%乙二胺四乙酸二钠或四钠（EDTA）溶液取EDTA0.2g溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中，使成1000mL。高压灭菌后使用。5.1.6抗菌素贮存液
取临床注射用青需素G100万单位及链霉素1g粉针，在无菌操作下溶于100mL灭菌蒸馏水中，使青霉素及链霉素在溶液中的浓度分别为1万单位及10000μg/mL，使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液1mL
5.1.7大鼠肝微粒体S9混合液（10%）每10L由以下成分组成，临用时配制：磷酸盐缓冲液（0.2mol/LpH7.4)氯化钾溶液（1.65mol/L）
KAONiKAca
氯化镁溶液（0.4mol/L）
6-磷酸葡萄糖溶液（0.05mol/L）辅酶Ⅱ（CoⅡ）溶液（0.25mol/L）肝S9液
混匀，置冰浴中待用。
5.1.8显影液及定影液（放射自显影用）5.1.8.1KodakD-170显影液
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贮液：无水亚硫酸钠25g.漠化钾1g，加水至200mL。使用时用水稀释至1000mL，溶入2-氨基酚盐酸盐（amitol)4.5g。
5.1.8.2KodakD-196显影液
水（50℃)500ml顺次溶人米吐尔（硫酸对甲氨基苯酚）2g、无水业硫酸钠72g、对苯二酚8.8g、无水碳酸钠48g、溴化钾4加水至1000mL。5.1.8.3
停显液
98%冰乙酸15mL，加水至1000mL
KodakF-5定影液
水（50
C)100mL，依次落人统代硫酸钠
7.5g、钾矾15g加水至1000
5.1.90.25mol/L及0.5mol/L高氯酸70%高氯酸（售品）8.57
闪烁液
硫酸钠
艺酸48mL、硼酸（结晶）
培比稀释至所需浓度
2,5-二苯基恶唑（PPO)5g、1,4-双[5-苯基嗯唑基-2}-苯（POPOP)3009g溶于甲苯中，配成1000mL。
5.2器材
玻璃类
在白来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5in，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净。十后浸于清洁液内过夜。取出后用白来水反复冲洗12次。再用蒸馅水冲洗2次，丁蒸馏水中浸泡24h。取出后用蒸馏水再冲洗2次，烘干。所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端管内塞入棉花栓后用纸包裹。
5.2.2橡皮类
自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸。若为新购置的，则用4%氢氧化钠煮沸10min，再用4%盐酸煮沸10min。自来水流水冲洗2h以上。再于蒸馅水中煮沸2次，用蒸馏水冲洗后，浸泡于蒸馏水中24h，干燥后，用玻璃纸包装，置于容器内。5.2.36号玻璃滤器（除菌用）
新购置的滤器浸人含少量亚硝酸钠的热硫酸内24h，蒸馏水抽滤后，用氢氧化钠溶液抽滤至中性，3
-iiKAoNiKAca
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再用双蒸水抽滤2次，烘干后配上橡皮塞后包扎。滤器使用后立即用蒸馏水抽滤一次，随后用1%亚硝酸钠硫酸溶液（硫酸溶液浓度0.5mol/L）抽滤后，浸于该硫酸溶液内（注意应使滤板的两侧都浸于酸内）。清水冲洗后，用蒸馅水抽滤3次，干燥后，配塞包扎。5.2.4器材的消毒
不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌，温度升至140℃后，保持2h。橡皮类及带橡皮塞的玻具应高压灭菌（120℃，30min）。溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用115C,10min。
6试验方法
6.1试剂和受试物制备
6.1.1溶剂/溶媒的选择
受试物和对照物都应用培养基配制或者溶解在适当的溶剂中，然后用培养基稀释后用于试验。终浓度不应影响细胞活力。在必须使用溶媒时，应尽可能使溶媒浓度降低，以免影响细胞的存活率和增殖率。如用二甲基亚砜作溶媒时，其在培养基中的终浓度应低于1%。溶剂浓度在所有受试组的培养基中应保持一致。
6.1.2对照
在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂)对照。6.1.3阳性对照物
大鼠肝细胞试验中阳性对照物选择7,12-二甲基苯葱（7,12-DMBA)或2-乙酰氨基荔（2-AAF）。对于已建系的细胞系，用放射自显影或液闪仪方法，在无代谢活化系统时选择4-硝基喹啉（4-NQQ）作为阳性对照物，在有代谢活化系统时可用N-二甲基亚硝胺（NDMA)作为阳性对照物。6.1.4细胞和培养条件
原代培养物（如大鼠肝细胞）、人淋巴细胞或已建系的细胞系（如人的二倍体成纤维细胞）都可以用于试验。已建立的细胞系应该定期检测是否有支原体污染。6.1.5受试物剂量设置
受试物至少应设置5个可供分析的浓度剂量组（5个～10个）。使用放射自显影技术检测UDS时，每个试验组至少需要2个细胞培养样本；用液闪技术测UDS时，每个试验点则需6个以上平行样本。受试物最高浓度的选择由预试验获得，是基于细胞毒性。无毒性受试物的最高浓度应达10mmol/L或5mg/mL，有毒性受试物的最高浓度应出现细胞毒性反应，使细胞存活数减少。在无明显毒性到24h无细胞存活浓度范围内选择5个以上剂量进行试验。6.2试验步骤
6.2.1细胞的传代、维持和贮存
哺乳动物原代肝细胞的短期培养物选用新分离的贴壁生长的肝细胞，以培养液培养。人淋巴细胞可用全血经白细胞分离液分离获得。其他的细胞系可由原培养物传代获得。生长成单层的细胞，除去培养基。用Hanks平衡盐溶液（HBSS)洗涤后，用0.02%EDTA或0.1%4
TIKAONiTKAca
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胰酶溶液（无Ca、Mg?+的磷酸缓冲液中）于37℃下处理数分钟，使细胞退缩，细胞间隙增加。再用HBSS洗涤1次，加入适量培养基，反复吹吸，使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液1滴，加于血球计数池中，计数四大格中的细胞数，计算出悬液中的细胞浓度（四大格的细胞数/4义104即为每毫升所含细胞数）。将细胞悬液用生长用培养基稀释至0.5×10/mL～1×10°/mL。将上述细胞悬液接种于培养瓶中（30mL培养瓶可接种3mL，100mL的可接种10mL）。每次接种3份，长成融合单层后取其中1瓶再按以上方法传代接种3瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供试验所用，这样可保证细胞在试验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。将细胞增殖至所需数量后，按上法制成细胞悬液（于生长用培养基中）。细胞浓度为1×10°/mL～1.5×10\/mL。在冰浴中，逐滴加人为细胞悬液总量10%的灭菌二甲基亚砜。然后将细胞悬液分装于洁净干燥的灭菌安颜或细胞冻存专用塑料小管中，每份1mL。封口后，置于4℃中2h~3h，然后移至普通冰箱的冰格内4h~5h，再移入一30℃～一20℃的低温冰箱内过夜。次日晨将安额移至生物用液氮贮存器内。需用时，将安瓶或小管白液氮中取出，锯（打）开，除去含有二甲亚矾的培养基，加入适量生长用培养基，并调整细胞浓度至1X10°/mL~1.5×10/mL。分种于细胞培养瓶中，37C培养1h后，换培养基一次，将无活力的细胞除去，待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供试验所用。6.2.2UDS的放射自显影显示法下载标准就来标准下载网
将细胞增殖至所需数量后，按上述方法制成单细胞悬液，细胞悬于生长用培养基中。浓度为0.5×10°/mL~1×10/mL。将上述细胞悬液接种于置有小盖片（18mmX6mm）的培养瓶中，37℃培养1d~3d，使细胞在盖片上生长至适当密度。培养瓶接种数目根据受试物的数目、所选剂量级别而定每一剂量作2个~3个样片，并另备4个~6个样本供溶剂对照和已知致癌物的阳性对照用。细胞在增殖培养后，以同步培养用培养基（ADM补以1%小牛血清）作同步培养3d～4d。在试验前一天下午，加人溶于ADM的羟基脲（HU)溶液，使HU在培养基中的终浓度为10mmol/L。继续在37C下孵育16h，然后将上述长有细胞的盖片置于含有不同浓度的受试物、HU（浓度为10mmol/L）及’H-胸腺嘧啶核苷（1.9×105Bq/mL~3.7×105Bq/mL，1.1×102Bq/mmol）的同步用培养基中。37℃中孵育5h。以溶剂及已知致癌物为对照。受试物及已知致癌物溶液在试验时新鲜配制。先将它们溶于适当溶剂（蒸馏水、二甲基业砜、丙酮等）中，配成最高测试浓度100倍的贮液。再依次以溶剂按10倍稀释，配成不同浓度的受试物溶液。将各种浓度的受试物溶液加于培养基中，使溶剂的最终浓度为1%。孵育结束后，用HBSS充分洗涤，用1%柠檬酸钠溶液处理10min，随后用乙醇-冰乙酸（3：1)固定（4℃）过夜，空气中干燥后，用少量中性树胶将盖片粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上，45C烘烤24 h。
在暗室中，将适量核-4乳胶移入浸溃用的玻璃器皿中，置于40℃水浴中令其融化，同时取等量蒸馏水于一量筒中也置于该水浴中加热。待乳胶融化后，将热蒸馏水倾于乳胶液中，继续在水浴中加温，并用玻璃棒轻轻搅拌，等待10min～20min，使气泡逸出。在以上准备过程中，将准备作自显影处理的玻片置于水浴平台上预热。准备就绪后，将玻片垂直浸渍于1：1稀释的乳胶液中约5s，徐徐提出玻片，并将玻片背面的乳胶用纱布或擦镜纸拭去。将已涂有乳胶的玻片移人温度为29C及一定湿度的温箱中（4h）待乳胶干洞。然后置于内置适量干燥剂（变色硅胶）袋的曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸，置于4℃冰箱中曝光10d。爆光结束后，将玻片移人有机玻璃制成的玻片架上，在液温为19℃的D-170或D-196显影液中显影5min在停显液中漂洗2min，在F-5定影液中定影6min~lomin，再用水漂洗数小时。
细胞可在乳胶涂片前用地衣红（2%）冰乙酸溶液或在显影后用H.E或Giemsa染液染色。将玻片脱水透明后，用盖片封固。5
irkoNiKca
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在油镜下，计数各样本细胞核上的显影银粒数，同时计数相当面积的本底银粒数，并计算出两者的差值。计数30个~50个细胞核，计算出对照组，各受试物组及阳性对照组的银粒数的均值和标准差等统计量。
6.2.3UDS的液体闪炼计数显示法将试验用细胞悬于生长用培养基中，细胞浓度为0.5×10°/mL，将细胞接种于液体闪烁计数瓶中，每瓶1mL，并加人1*C胸腺嘧啶核苷使终浓度为3.7×102Bq/mL（1.9×10°Bg/mmol)。37℃中培养48h，使细胞增殖并预标记，去培养基并用HBSS洗涤后，换以含14C-胸腺嘧啶核苷（3.7×10°Bq/mL）的同步用培养基，在37℃中同步培养2d～4d。同步培养结束后，于试验前一天下午去培养基，用HBSS充分洗涤后，加人含有浓度为10mmol/L羟基腺（HU)的同步用培养基，37℃中孵育16h，UDS的诱发同放射自显影显示法。细胞在含有HU及\H-胸腺嘧啶核苷（1.9×105Bq/mL，1.1X1012Bq/mmol)的同步用培养基中与不同浓度受试物接触5h，孵育结束后，去培养基及受试物。以冷盐水洗涤2次，随后用冰冷的0.25mol/L高氯酸溶液处理2次，每次2min，以固定细胞并除去酸可溶性成分，再用乙醇处理10min以除去脂溶性成分及未掺入的标记物，十后以0.5mol/L~1.0mol/L高氯酸0.5L于75~80℃恒温箱中水解40min，使掺入的标记物释出。冷却后加入乙二醇乙醚3.5ml及闪烁液（PPO0.5%、POPOP0.03%，以甲苯为溶剂）5mL，振摇后使呈勾相，以液体闪烁计数器测定各样本中4C及\H的放射活性
标本中的H放射活性即反映UDS中H-胸腺嘧啶核苷的掺人量；而C的放射活性反映实验细胞的数目或其DNA量，因此H和14C放射活性比(3H/C)即为单位质量DNA或单位数目细胞中UDS水平的反值。若将溶剂对照的H和C比值作为100%（1.00），可计算出各个样本中对于对照的变化量，并计算各受试物浓度的样本中的有关统计量。试验结果最好通过重复试验验证。7试验结果评价
7.1阳性结果
在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：放射性标记物的掺人量在两个以上受试组中出现剂量依赖性增高，且与阴性对照组相比有显a）
著性差异；
b）至少在一个剂量组得到可重复并有统计学意义的掺入量增加。7.2阴性结果
不符合以上阳性结果标准的受试物可认为在本试验系统中无致突变性。在评价时应把生物学意义和统计学意义结合考虑。8试验报告
试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；b)
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期；d）试验摘要；
KAONiKAca
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受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、e
剂型、生产日期（批号）、外观性状、配制所用溶剂和方法；f
细胞株名称；
试验条件和方法：
包括主要仪器和设备，所用的细胞系名称、来源、生长及培养条件、制备方法；阳性对照物的选择和制备，阴性对照（空白和/或溶剂对照)的设置；代谢活化系统的获得和在试验中使用情况的描述；染毒条件和情况的描述，包括染毒浓度、染毒持续时间等；阻断细胞进人S期的方法和步骤；应用放射白显影技术细胞清洗、制片、放射白显影处理过程、染色、计数方法的描述使用液闪技术时的提取方法及总含量的测定方法和过程的描述；试验结果：受试物对细胞株的毒性、是否具有剂量反应关系、统计结果、同时进行的溶媒对照和阳性对照的均数和标准差；
试验结论：给出受试物在试验条件下是否引起体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成增加的结论，必要时对有关问题进行讨论，原始记录保存情况的说明。
-TTKAONKACa
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张0.75字数17千字2017年7月第一次印刷
2017年7月第一版
书号：155066·1-54145定价16.00元告由本社发行中心调换
如有印装差错
版权专有侵权必究
举报电话：（010)68510107
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GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；
第2部分：急性经口毒性试验
霍恩氏法；
第3部分：急性经口毒性试验
序贯法；
第1部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验：
第6部分：急性吸人毒性试验；
第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验；第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验；第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验；第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验；第13部分：亚慢性毒性试验；
第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验；第18部分：啮齿类动物显性致死试验：第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验：第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；GB/T15670.22—2017
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；第23部分：致畸试验；
第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验；
第27部分：致癌试验；
第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验。本部分为GB/T15670的第22部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江。1
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GB/T1567O的本部分规定了体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验的基本原则、方法和要求
本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
程序外DNA合成
unscheduledDNA synthesis;UDS发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成。2.2
净核银粒netnucleargrain；NNG在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（CG)，即NNG=NG一CG。由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养物中的细胞NNG汇总。
3试验目的
该测试系统是通过对DNA修复合成水平的检测来评价受试物能否对原代哺乳动物细胞和已建立的哺乳动物细胞系的DNA造成损伤及损伤的程度。由于UDS反映损伤的切除修复过程，并反映出损伤的程度，因此可作为化学致癌剂短期生物学试验的判断终点。4试验概述
将分离和培养的非S期哺乳动物细胞移人含胸腺嘧啶核苷（\H-TdR)和受试物的培养瓶中，孵育一定时间后，观察H-TdR掺人情况，如果受试物造成了细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA修复，在修复过程中HTdR整合人DNA链中，造成\HI-TdR在修复后DNA中的掺人。再用放射性白显影或液体闪烁计数的方法米观察掺人H-TdR的量，掺入越多，说明受试物对DNA的损伤越广泛。除非采用肝原代细胞作为靶细胞，培养的哺乳动物细胞均要在加和不加外源性代谢活化系统两种情况下与受试物作用。
鉴于原代培养肝细胞存在易于分离培养、保留肝微粒体酶系等优点，建议用原代培养肝细胞作为试验的靶细胞。
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5试剂与器材
5.1试剂
注：全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。5.1.1细胞增殖用培养基
Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）85份，小牛血清15份，加人青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及1c0μg/mL。EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌，4C冰箱贮存。5.1.2同步用培养基
不含精氨酸的Dgle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）98份，小牛血清2份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。5.1.3Hanks平衡盐溶液（HBSS）贮液
将氩化钠
160g、氯化钾8硫酸镁MgS01.0)2g及氯化镁（MgC·6H0)2g溶于800ml双蒸水（50℃
60C中另取无永氯花钙2.8溶手100mL双蒸水中。将上述两溶液混合后，加
000mL.加人氣甲烷mL
贮液B：将磷酸氢二
(KH,PO
.2H20)1.2
钠NHPO,：
保存于
葡萄糖
（或Na
g溶解
g）磷酸二氢钾
mL双蒸水中，加人100mL
0.4%酚红溶液（取酚红1手mL1mol/L氢氧化钠中，待完
全蓉解后加人双蒸水中至25CmL），1000mL，加人二氯电烷2mL，保存于加水至1
贮液C.1.4%碳酸氢钠以双蒸水配CE
应用液的配制：取A液1份B液1份，水民份混合后分装于玻璃容器内，高压灵菌，4C保存。用前加人1.4%碳酸氢钠，将pl1调整至7.27磷酸缓冲液（无钙、镁的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液）（pH7.4）5.1.4
取氯化钠8.C0g、磷酸二氢钾0.20g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠（NHPO：12H,0)2.89g溶于
1000mL双蒸水中。
5.1.50.02%乙二胺四乙酸二钠或四钠（EDTA）溶液取EDTA0.2g溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中，使成1000mL。高压灭菌后使用。5.1.6抗菌素贮存液
取临床注射用青需素G100万单位及链霉素1g粉针，在无菌操作下溶于100mL灭菌蒸馏水中，使青霉素及链霉素在溶液中的浓度分别为1万单位及10000μg/mL，使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液1mL
5.1.7大鼠肝微粒体S9混合液（10%）每10L由以下成分组成，临用时配制：磷酸盐缓冲液（0.2mol/LpH7.4)氯化钾溶液（1.65mol/L）
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氯化镁溶液（0.4mol/L）
6-磷酸葡萄糖溶液（0.05mol/L）辅酶Ⅱ（CoⅡ）溶液（0.25mol/L）肝S9液
混匀，置冰浴中待用。
5.1.8显影液及定影液（放射自显影用）5.1.8.1KodakD-170显影液
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贮液：无水亚硫酸钠25g.漠化钾1g，加水至200mL。使用时用水稀释至1000mL，溶入2-氨基酚盐酸盐（amitol)4.5g。
5.1.8.2KodakD-196显影液
水（50℃)500ml顺次溶人米吐尔（硫酸对甲氨基苯酚）2g、无水业硫酸钠72g、对苯二酚8.8g、无水碳酸钠48g、溴化钾4加水至1000mL。5.1.8.3
停显液
98%冰乙酸15mL，加水至1000mL
KodakF-5定影液
水（50
C)100mL，依次落人统代硫酸钠
7.5g、钾矾15g加水至1000
5.1.90.25mol/L及0.5mol/L高氯酸70%高氯酸（售品）8.57
闪烁液
硫酸钠
艺酸48mL、硼酸（结晶）
培比稀释至所需浓度
2,5-二苯基恶唑（PPO)5g、1,4-双[5-苯基嗯唑基-2}-苯（POPOP)3009g溶于甲苯中，配成1000mL。
5.2器材
玻璃类
在白来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5in，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净。十后浸于清洁液内过夜。取出后用白来水反复冲洗12次。再用蒸馅水冲洗2次，丁蒸馏水中浸泡24h。取出后用蒸馏水再冲洗2次，烘干。所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端管内塞入棉花栓后用纸包裹。
5.2.2橡皮类
自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸。若为新购置的，则用4%氢氧化钠煮沸10min，再用4%盐酸煮沸10min。自来水流水冲洗2h以上。再于蒸馅水中煮沸2次，用蒸馏水冲洗后，浸泡于蒸馏水中24h，干燥后，用玻璃纸包装，置于容器内。5.2.36号玻璃滤器（除菌用）
新购置的滤器浸人含少量亚硝酸钠的热硫酸内24h，蒸馏水抽滤后，用氢氧化钠溶液抽滤至中性，3
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再用双蒸水抽滤2次，烘干后配上橡皮塞后包扎。滤器使用后立即用蒸馏水抽滤一次，随后用1%亚硝酸钠硫酸溶液（硫酸溶液浓度0.5mol/L）抽滤后，浸于该硫酸溶液内（注意应使滤板的两侧都浸于酸内）。清水冲洗后，用蒸馅水抽滤3次，干燥后，配塞包扎。5.2.4器材的消毒
不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌，温度升至140℃后，保持2h。橡皮类及带橡皮塞的玻具应高压灭菌（120℃，30min）。溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用115C,10min。
6试验方法
6.1试剂和受试物制备
6.1.1溶剂/溶媒的选择
受试物和对照物都应用培养基配制或者溶解在适当的溶剂中，然后用培养基稀释后用于试验。终浓度不应影响细胞活力。在必须使用溶媒时，应尽可能使溶媒浓度降低，以免影响细胞的存活率和增殖率。如用二甲基亚砜作溶媒时，其在培养基中的终浓度应低于1%。溶剂浓度在所有受试组的培养基中应保持一致。
6.1.2对照
在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂)对照。6.1.3阳性对照物
大鼠肝细胞试验中阳性对照物选择7,12-二甲基苯葱（7,12-DMBA)或2-乙酰氨基荔（2-AAF）。对于已建系的细胞系，用放射自显影或液闪仪方法，在无代谢活化系统时选择4-硝基喹啉（4-NQQ）作为阳性对照物，在有代谢活化系统时可用N-二甲基亚硝胺（NDMA)作为阳性对照物。6.1.4细胞和培养条件
原代培养物（如大鼠肝细胞）、人淋巴细胞或已建系的细胞系（如人的二倍体成纤维细胞）都可以用于试验。已建立的细胞系应该定期检测是否有支原体污染。6.1.5受试物剂量设置
受试物至少应设置5个可供分析的浓度剂量组（5个～10个）。使用放射自显影技术检测UDS时，每个试验组至少需要2个细胞培养样本；用液闪技术测UDS时，每个试验点则需6个以上平行样本。受试物最高浓度的选择由预试验获得，是基于细胞毒性。无毒性受试物的最高浓度应达10mmol/L或5mg/mL，有毒性受试物的最高浓度应出现细胞毒性反应，使细胞存活数减少。在无明显毒性到24h无细胞存活浓度范围内选择5个以上剂量进行试验。6.2试验步骤
6.2.1细胞的传代、维持和贮存
哺乳动物原代肝细胞的短期培养物选用新分离的贴壁生长的肝细胞，以培养液培养。人淋巴细胞可用全血经白细胞分离液分离获得。其他的细胞系可由原培养物传代获得。生长成单层的细胞，除去培养基。用Hanks平衡盐溶液（HBSS)洗涤后，用0.02%EDTA或0.1%4
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胰酶溶液（无Ca、Mg?+的磷酸缓冲液中）于37℃下处理数分钟，使细胞退缩，细胞间隙增加。再用HBSS洗涤1次，加入适量培养基，反复吹吸，使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液1滴，加于血球计数池中，计数四大格中的细胞数，计算出悬液中的细胞浓度（四大格的细胞数/4义104即为每毫升所含细胞数）。将细胞悬液用生长用培养基稀释至0.5×10/mL～1×10°/mL。将上述细胞悬液接种于培养瓶中（30mL培养瓶可接种3mL，100mL的可接种10mL）。每次接种3份，长成融合单层后取其中1瓶再按以上方法传代接种3瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供试验所用，这样可保证细胞在试验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。将细胞增殖至所需数量后，按上法制成细胞悬液（于生长用培养基中）。细胞浓度为1×10°/mL～1.5×10\/mL。在冰浴中，逐滴加人为细胞悬液总量10%的灭菌二甲基亚砜。然后将细胞悬液分装于洁净干燥的灭菌安颜或细胞冻存专用塑料小管中，每份1mL。封口后，置于4℃中2h~3h，然后移至普通冰箱的冰格内4h~5h，再移入一30℃～一20℃的低温冰箱内过夜。次日晨将安额移至生物用液氮贮存器内。需用时，将安瓶或小管白液氮中取出，锯（打）开，除去含有二甲亚矾的培养基，加入适量生长用培养基，并调整细胞浓度至1X10°/mL~1.5×10/mL。分种于细胞培养瓶中，37C培养1h后，换培养基一次，将无活力的细胞除去，待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供试验所用。6.2.2UDS的放射自显影显示法下载标准就来标准下载网
将细胞增殖至所需数量后，按上述方法制成单细胞悬液，细胞悬于生长用培养基中。浓度为0.5×10°/mL~1×10/mL。将上述细胞悬液接种于置有小盖片（18mmX6mm）的培养瓶中，37℃培养1d~3d，使细胞在盖片上生长至适当密度。培养瓶接种数目根据受试物的数目、所选剂量级别而定每一剂量作2个~3个样片，并另备4个~6个样本供溶剂对照和已知致癌物的阳性对照用。细胞在增殖培养后，以同步培养用培养基（ADM补以1%小牛血清）作同步培养3d～4d。在试验前一天下午，加人溶于ADM的羟基脲（HU)溶液，使HU在培养基中的终浓度为10mmol/L。继续在37C下孵育16h，然后将上述长有细胞的盖片置于含有不同浓度的受试物、HU（浓度为10mmol/L）及’H-胸腺嘧啶核苷（1.9×105Bq/mL~3.7×105Bq/mL，1.1×102Bq/mmol）的同步用培养基中。37℃中孵育5h。以溶剂及已知致癌物为对照。受试物及已知致癌物溶液在试验时新鲜配制。先将它们溶于适当溶剂（蒸馏水、二甲基业砜、丙酮等）中，配成最高测试浓度100倍的贮液。再依次以溶剂按10倍稀释，配成不同浓度的受试物溶液。将各种浓度的受试物溶液加于培养基中，使溶剂的最终浓度为1%。孵育结束后，用HBSS充分洗涤，用1%柠檬酸钠溶液处理10min，随后用乙醇-冰乙酸（3：1)固定（4℃）过夜，空气中干燥后，用少量中性树胶将盖片粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上，45C烘烤24 h。
在暗室中，将适量核-4乳胶移入浸溃用的玻璃器皿中，置于40℃水浴中令其融化，同时取等量蒸馏水于一量筒中也置于该水浴中加热。待乳胶融化后，将热蒸馏水倾于乳胶液中，继续在水浴中加温，并用玻璃棒轻轻搅拌，等待10min～20min，使气泡逸出。在以上准备过程中，将准备作自显影处理的玻片置于水浴平台上预热。准备就绪后，将玻片垂直浸渍于1：1稀释的乳胶液中约5s，徐徐提出玻片，并将玻片背面的乳胶用纱布或擦镜纸拭去。将已涂有乳胶的玻片移人温度为29C及一定湿度的温箱中（4h）待乳胶干洞。然后置于内置适量干燥剂（变色硅胶）袋的曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸，置于4℃冰箱中曝光10d。爆光结束后，将玻片移人有机玻璃制成的玻片架上，在液温为19℃的D-170或D-196显影液中显影5min在停显液中漂洗2min，在F-5定影液中定影6min~lomin，再用水漂洗数小时。
细胞可在乳胶涂片前用地衣红（2%）冰乙酸溶液或在显影后用H.E或Giemsa染液染色。将玻片脱水透明后，用盖片封固。5
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在油镜下，计数各样本细胞核上的显影银粒数，同时计数相当面积的本底银粒数，并计算出两者的差值。计数30个~50个细胞核，计算出对照组，各受试物组及阳性对照组的银粒数的均值和标准差等统计量。
6.2.3UDS的液体闪炼计数显示法将试验用细胞悬于生长用培养基中，细胞浓度为0.5×10°/mL，将细胞接种于液体闪烁计数瓶中，每瓶1mL，并加人1*C胸腺嘧啶核苷使终浓度为3.7×102Bq/mL（1.9×10°Bg/mmol)。37℃中培养48h，使细胞增殖并预标记，去培养基并用HBSS洗涤后，换以含14C-胸腺嘧啶核苷（3.7×10°Bq/mL）的同步用培养基，在37℃中同步培养2d～4d。同步培养结束后，于试验前一天下午去培养基，用HBSS充分洗涤后，加人含有浓度为10mmol/L羟基腺（HU)的同步用培养基，37℃中孵育16h，UDS的诱发同放射自显影显示法。细胞在含有HU及\H-胸腺嘧啶核苷（1.9×105Bq/mL，1.1X1012Bq/mmol)的同步用培养基中与不同浓度受试物接触5h，孵育结束后，去培养基及受试物。以冷盐水洗涤2次，随后用冰冷的0.25mol/L高氯酸溶液处理2次，每次2min，以固定细胞并除去酸可溶性成分，再用乙醇处理10min以除去脂溶性成分及未掺入的标记物，十后以0.5mol/L~1.0mol/L高氯酸0.5L于75~80℃恒温箱中水解40min，使掺入的标记物释出。冷却后加入乙二醇乙醚3.5ml及闪烁液（PPO0.5%、POPOP0.03%，以甲苯为溶剂）5mL，振摇后使呈勾相，以液体闪烁计数器测定各样本中4C及\H的放射活性
标本中的H放射活性即反映UDS中H-胸腺嘧啶核苷的掺人量；而C的放射活性反映实验细胞的数目或其DNA量，因此H和14C放射活性比(3H/C)即为单位质量DNA或单位数目细胞中UDS水平的反值。若将溶剂对照的H和C比值作为100%（1.00），可计算出各个样本中对于对照的变化量，并计算各受试物浓度的样本中的有关统计量。试验结果最好通过重复试验验证。7试验结果评价
7.1阳性结果
在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：放射性标记物的掺人量在两个以上受试组中出现剂量依赖性增高，且与阴性对照组相比有显a）
著性差异；
b）至少在一个剂量组得到可重复并有统计学意义的掺入量增加。7.2阴性结果
不符合以上阳性结果标准的受试物可认为在本试验系统中无致突变性。在评价时应把生物学意义和统计学意义结合考虑。8试验报告
试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；b)
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期；d）试验摘要；
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受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、e
剂型、生产日期（批号）、外观性状、配制所用溶剂和方法；f
细胞株名称；
试验条件和方法：
包括主要仪器和设备，所用的细胞系名称、来源、生长及培养条件、制备方法；阳性对照物的选择和制备，阴性对照（空白和/或溶剂对照)的设置；代谢活化系统的获得和在试验中使用情况的描述；染毒条件和情况的描述，包括染毒浓度、染毒持续时间等；阻断细胞进人S期的方法和步骤；应用放射白显影技术细胞清洗、制片、放射白显影处理过程、染色、计数方法的描述使用液闪技术时的提取方法及总含量的测定方法和过程的描述；试验结果：受试物对细胞株的毒性、是否具有剂量反应关系、统计结果、同时进行的溶媒对照和阳性对照的均数和标准差；
试验结论：给出受试物在试验条件下是否引起体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成增加的结论，必要时对有关问题进行讨论，原始记录保存情况的说明。
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国家标准
农药登记毒理学试验方法
第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验
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2017年7月第一版
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