NY/T 939-2016 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定 NY/T939-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国农业行业标准
NY/T939—2016
代替NY/T939—2005
巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定Identification of reconstituted milk in pasteurized and UHT mill本文件为参考件
以正式纸质版标准为准
2016-03-23发布
2016-04-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。与NY/T939—2005相比，主要变化如下：修改了巴氏杀菌乳中复原乳鉴定的指标值；修改了UHT灭菌乳中复原乳鉴定的指标值；修改了糠氨酸测定前处理方法；增加了糠氨酸的UPLC测定方法；修改了乳果糖的测定方法。
本标准由农业部畜牧业司提出
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。NY/T939—2016
本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。本标准主要起草人：郑楠、文芳、王加启、李松励、张养东、赵圣国、李明、杨晋辉、陈冲冲、王晓晴、陈美霞、汪慧、兰欣怡、黄萌萌、卜登攀、魏宏阳、李树聪、于建国、周凌云。本文件为参考件
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1范围
巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定本标准规定了巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定方法本标准适用于巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳。2规范性引用文件
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下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5009.5食品安全国家标准食品中蛋白质的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T10111随机数的产生及其在产品质量抽样检验中的应用程序3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
生乳rawmilk
从符合国家有关要求的健康奶畜乳房中，挤出的无任何成分改变的常乳。3.2
复原乳
将干燥白
热处理
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采用加热技术且强度不低于巴氏杀菌，抑制微生物生长或杀灭微生物，同时控制受热对象物理化学性状只发生有限变化的操作。
巴氏杀菌pasteurization
为有效杀灭病原性微生物而采用的加工方法，即经低温长时间（63℃～65℃保持30min）或经高温短时间（72℃～76℃，保持15s；或80℃~85℃，保持10s~15s）的处理方式3.5
巴氏杀菌乳pasteurizedmilk
仅以生牛乳为原料，经巴氏杀菌等工序制得的液体产品，其乳果糖含量应小于100mg/L。3.6
超高温瞬时灭菌ultrahigh-temperatureUHI为有效条灭微生物和抑制耐热芽抱而采用的加工方法，即在连续流动状态下加热到至少132℃并保持很短时间的热处理方式。
超高温瞬时灭菌乳（UHT灭菌乳）ultrahigh-temperaturemilk以生牛乳为原料，添加或不添加复原乳，经超高温瞬时灭菌，再经无菌灌装等工序制成的液体产品1
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生牛乳经UHT灭菌处理后，乳果糖含量应小于600mg/L。3.8
糠氨酸furosine
牛乳在加热过程中，氨基酸、蛋白质与乳糖通过美拉德反应生成e-N-脱氧乳果糖基-L-赖氨酸(e-N-deoxylactolusyl-L-lysine），经酸水解转换成更稳定的糠氨酸（-N-2-furoylmethyl-L-lysine，ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸）。3.9
乳果糖lactulose
牛乳在加热过程中，乳糖在酪蛋白游离氨基的催化下，碱基异构而形成的一种双糖。其化学名称为4-o-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，可作为评价牛奶热处理效应的指标。4试验方法
4.1糠氨酸含量的测定
4.1.1原理
试样经盐酸水解后测定蛋白质含量，水解液经稀释后用高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)在紫外（波长280nm）检测器下进行分析，外标法定量。4.1.2试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的实验室一级水。4.1.2.1甲醇（CHOH)：色谱纯。4.1.2.2
浓盐酸（HCl,密度为1.19g/mL）4. 1.2.3
4. 1. 2.7
本文件为参考件
式纸质版准为准
乙酸铵溶液（6g）
脱气10min。
，过0.22μm水相滤膜，超声
4.1.2.9乙酸铵（6g/L)含0.1%三氟乙酸溶液：准确称量6g乙酸铵溶于部分水中，加入1mL三氟乙酸，定容至1L.过0.22μm水相滤膜，超声脱气10min。4.1.2.10糠氨酸标准储备溶液（500.0mg/L）：将糠氨酸标准品按标准品证书提供的肽纯度系数（NetPeptideContent)换算后，用3mol/L盐酸溶液配制成标准储备溶液。一20℃条件下可储存24个月示例：
糠氨酸标准品证书上标注肽纯度系数为69.1%，则称取7.24mg糖氨酸标准品，用3mol/L盐酸溶液溶解并定容至10mL，标准储备济液的浓度为500.0mg/L，4.1.2.11糠氨酸标准工作溶液（2.0mg/L)：移取100μL糠氨酸标准储备溶液于25mL容量瓶，以3mol/L盐酸溶液定容。此标准工作溶液浓度即为2.0mg/L。4.1.2.12水相滤膜：0.22μm。
4.1.3仪器
4.1.3.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.1.3.2超高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.1.3.3干燥箱：(110±2)℃。
4.1.3.4密封耐热试管：容积为20mL。4.1.3.5天平：感量为0.01mg.1mg。4.1.3.6凯氏定氮仪。
4.1.4采样
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用于检测的巴氏杀菌乳储存和运输温度为2℃～6℃，UHT灭菌乳储存和运输温度不高于25℃按GB/T10111的规定取不少于250mL样品，样品不应受到破坏或者在转运和储藏期间发生变化。监督抽检或仲裁检验等采样应到加工厂抽取成品库的待销产品，1周内测定。4.1.5分析步骤
4.1.5.1试样水解液的制备
吸取2.00mL试样，置于密闭耐热试管中，加入6.00mL10.6mol/L盐酸溶液，混匀。密闭试管置于干燥箱，在110℃下加热水解12h～23h。加热约1h后，轻轻摇动试管。加热结束后，将试管从干燥箱中取出.冷却后用滤纸过滤，滤液供测定。4.1.5.2试样水解液中蛋白质含量的测定移取2.00mL试样水解液，按GB5009.5的规定测定试样溶液中的蛋白质含量。4.1.5.3试样水解液中糠氨酸含量的测定移取1.00mL试样水解液，加人5.00mL的6g/L乙酸铵溶液，混勾，过0.22μm水相滤膜，滤液供上机测定。根据实验室配备的液相色谱仪器，按以下两种方法之一测定：a）HPLC法测定
1）色谱参考条件
色谱柱：Cis硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5um粒径，或相当者。本文生为参考件
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2）测定
mL/mir
动相E
利用流动相A和流动相B的混合液（50：50)以1mL/min的流速平衡色谱系统。然后，用初始流动相平衡系统直至基线平稳。注入10μuL3mol/L盐酸溶液，以检测溶剂的纯度。注人10L待测溶液测定糠氨酸含量。色谱图参见附录A。b）UPLC法测定
1）色谱参考条件
色谱柱：HSST3高强度硅胶颗粒色谱柱，100mmX2.1mm，1.8μm粒径，或相当者。柱温：35℃。
流动相：6g/L乙酸铵含0.1%三氟乙酸水溶液为流动相A.甲醇为流动相B.纯水为流动相C。洗脱条件：流动相A，等度洗脱0.4mL/min。2）测定
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宜使用流动相纯水和甲醇，依次冲洗色谱系统；仪器使用前，使用流动相纯水过渡，用流动相A以0.4mL/min的流速平衡色谱柱。注人0.5uL3mol/L盐酸溶液，以检测溶剂的纯度。注入0.5L待测溶液测定糖氨酸含量。色谱图参见附录A4.1.6结果计算
4.1.6.1试样中糠氨酸含量
糠氨酸含量以质量分数F计，数值以毫克每百克蛋白质（mg/100g蛋白质）表示，按式（1）计算F= A.XCdXDX100
AstdXm
式中：
测试样品中糖氨酸峰面积的数值糖氨酸标准溶液中糠氨酸峰面积的数值；糖氨酸标准溶液的浓度，单位为毫克每升（mg/L)；测定时稀释倍数（D=6)；
样品水解液中蛋白质浓度，单位为克每升（g/L）。计算结果保留至小数点后一位
4.1.6.2巴氏杀菌乳杀菌结束时糠氨酸含量(1)
巴氏杀菌乳杀菌结束时，糠氨酸含量以FT计，数值以毫克每自克蛋白质（mg/100g蛋白质）表示，按式（2）计算。
计算结果保留至小数点后一位。4.1.6.3UHT灭菌乳灭菌结束时糠氨酸含量UHT灭菌乳
本文件为参考件
示，按式（3）
式中：
（2）
100g蛋白质）表
正式纸质版标准内馆
/100g蛋
样品在常温下储存天数。
计算结果保留至小数点后一位
4.1.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的20%。4.1.8检出限
HPLC法和UPLC法的检出限均为1.0mg/100g蛋白质。4.2乳果糖含量的测定
4.2.1原理
试样经β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase)水解后产生半乳糖（galactose）和果糖（fructose），通过酶法测定产生的果糖量计算乳果糖含量。试样中加入硫酸锌和亚铁氰化钾溶液，沉淀脂肪和蛋白质。滤液中加人β-D-半乳糖苷酶，在β-D-半乳糖苷酶作用下乳糖水解为半乳糖和葡萄糖（glucose），乳果糖水解为半乳糖和果糖：乳糖+H:O-B-D-半乳糖苷度、半乳糖+葡萄糖乳果糖+H:OP-D-半乳糖苷胎、半乳糖+果糖4
再加人葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD），将大部分葡萄糖氧化为葡萄糖酸：葡萄糖+H:O+O.葡萄精氯化酶、葡萄糖酸+H:O上述反应生成的过氧化氢，可以加人过氧化氢酶除去：2H:O。过氧化氢酶-2H.O+0
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少量未被氧化的葡萄糖和乳果糖水解生成的果糖，在已糖激酶（hexokinase，HK)的催化作用下与腺苷三磷酸酯（AdenosineTrihosphate，ATP）反应，分别生成葡萄糖-6-磷酸酯（glucose-6-phosphate)和果糖-6-磷酸酯（fructose-6-phosphate)：葡萄糖+ATP已糖激酶葡萄糖-6-磷酸酯+ADP果糖+ATP已糖激酶-果糖-6-磷酸酯+ADP反应生成的葡萄糖-6-磷酸酯在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6-PD）催化作用下，与氧化型辅酶Ⅱ，即烟酰胺腺呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADP+)反应生成还原型辅酶Ⅱ，即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)：葡萄糖-6-磷酸酯+NADP+葡萄磷-6-磷酸脱氨酶-6-磷酸葡萄糖酸盐+NADPH+H+反应生成的NADPH可在波长340nm处测定。但是，果糖-6-磷酸酯需用磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase，PGI转化为葡萄糖-6-磷酸酯：果糖-6-磷酸酯磷酸葡萄糖异构胆-葡萄糖-6-磷酸酯生成的葡萄糖-6-磷酸酯再与NADP+反应，并于波长340nm处测定吸光值。通过两次测定结果之差计算乳果糖含量。样品原有的果糖，可通过空白样品的测定扣除。空白样品的测定与样品测定步骤完全相同.只是不加β-D-半乳糖苷酶。4.2.2i
本文为参老件
除非另
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碳酸氢钠（NaHCO）。
硫酸锌（ZnSO：7H,O)。
亚铁氰化钾(K.[Fe(CN)。］·3H,O)。氢氧化钠（NaOH）。
硫酸铵[(NH）2SO]。
磷酸氢二钠（NazHPO4）。
4.2.2. 11
磷酸二氢钠NaH,PO·H,O）。
硫酸镁（MgSO4：7H,O)。
三乙醇胺盐酸盐[N(CH,CH,OH),HC]4.2.2.13β-D-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23)：fromAspergillusoryzae，活性为12.6IU/mg。4. 2. 2. 14
4. 2. 2. 15
4.2.2. 17
葡萄糖氧化酶（EC1.1.3.4)：fromAspergillusniger，活性为200IU/mg。过氧化氢酶（EC1.11.1.6）：frombeefliver，活性为65000IU/mg已糖激酶（EC2.7.1.1)：frombakersyeast，活性为140IU/mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC1.1.1.49)：frombaker'syeast，活性为140IU/mg磷酸葡萄糖异构酶（EC5.3.1.9）：fromyeast，活性为350IU/mg。5
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4.2.2.195\-腺苷三磷酸二钠盐（5'-ATP-Na2）。4.2.2.20烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐（β-NADP-Naz）。4.2.2.21
硫酸锌溶液（168g/L）：称取300g硫酸锌溶于800mL水中，定容至1L。4.2.2.22
亚铁氰化钾溶液（130g/L）：称取150g亚铁氰化钾溶于800mL水中，定容至1L。4.2.2.23氢氧化钠溶液（0.33mol/L)：将1.32g氢氧化钠溶于100mL水中。4.2.2.24氢氧化钠溶液（1mol/L)：将4g氢氧化钠溶于100mL水中。4.2.2.25
硫酸铵溶液（3.2mol/L）：将42.24g硫酸铵溶于100mL水中4.2.2.26缓冲液A（pH为7.5）：称4.8g磷酸氢二钠、0.86g磷酸二氢钠和0.1g硫酸镁溶解于80mL水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.5土0.1（20℃），定容到100mL。4.2.2.27缓冲液B(pH为7.6)：称取14.00g三乙醇胺盐酸盐和0.25g硫酸镁溶解于80mL水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.6土0.1（20℃）,定容到100mL。4.2.2.28缓冲液C:量取40.0mL缓冲液B,用水定容到100mL，摇匀。4.2.2.29β-D-半乳糖苷酶悬浮液（150mg/mL）：用3.2mol/L硫酸铵溶液将活性为12.6IU/mg的β-D-半乳糖苷酶制备成浓度为150mg/mL的悬浮液。现用现配，配制时切勿振荡。4.2.2.30葡萄糖氧化酶悬浮液（20mg/mL)：用灭菌水将活性为200IU/mg的葡萄糖氧化酶制备成浓度为20mg/mL的悬浮溶液。现用现配4.2.2.31过氧化氢酶悬浮液（20mg/mL）：用灭菌水将活性为65000IU/mg的过氧化氢酶制备成浓度为20mg/mL的悬浮液。4℃保存，用前振荡使之均匀。4.2.2.32已糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液：在1mL3.2mol/L硫酸铵溶液中加入2mg活性为140IU/mg的已糖激
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一20℃保存
经轻摇动成悬浮液。
350IU/mg的
磷酸葡萄糖异构酶制备成浓度为2mg/mL的悬浮液。。4℃保值
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水中。—20
纳溶于1mL
4.2.2.35烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)溶液：将10mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐溶于1mL水中。一20℃保存。
4.2.3仪器
4.2.3.1恒温培养箱：（40±2)℃，(50±2)℃。4.2.3.2分光光度计：340nm
4.2.4采样
同4.1.4。
4.2.5分析步骤
4.2.5.1纯化
量取20.0mL样品到200mL锥形瓶.依次加人20.0mL水、7.0mL亚铁氰化钾溶液、7.0mL硫酸锌溶液和26.0mL缓冲液A。每加入一种溶液后，充分振荡均匀。全部溶液加完后，静置10min，过滤弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液。4.2.5.2水解乳糖和乳果糖
吸取5.00mL滤液置于10mL容量瓶中，加200uL的β-D-半乳糖苷酶悬浮液。混匀后加盖，在50℃恒温培养箱中培养1h。
4.2.5.3葡萄糖氧化
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在水解后的试液中依次加入2.0mL缓冲液C,100L葡萄糖氧化酶悬浮液，1滴辛醇，0.5mL0.33mol/L氢氧化钠溶液，50μL过氧化氢和50L过氧化氢酶悬浮液。每加一种试剂后，应轻轻摇匀。全部溶液加完后，在40℃恒温培养箱中培养3h。冷却后用水定容至10mL，过滤。弃去最初的1mL~2mL滤液，收集滤液。
4.2.5.4空白
依照4.2.5.2到4.2.5.3步骤处理空白溶液，但不加β-D-半乳糖苷酶悬浮液。4.2.5.5测定
见表2。
比色皿中依次加入
缓冲液B
ATP溶液
NADP溶液
混合均匀后.静置3min
加人已糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液混合均匀，等反应停止后（约10min），记录吸光值加人磷酸葡萄糖异构酶悬浮液
混合均匀，等反应停止后（10min~15min），记录吸光值测定步骤
注1：以上反见
本文件为参考件
注2：如果
样品吸
20 μL
以正式纸质版标准为准
空白吸光值差△A,按式（5)计算。A,=A62-Ah
样品净吸光值差AA.按式（6）计算AL=4A,-AA,
乳果糖含量
乳果糖的含量以质量浓度L计，数值以毫克每升(mg/L)表示，按式（7)计算MLXViX8
式中：
样品净吸光值差；
乳果糖的摩尔质量（342.3g/mol)；NADPH在340nm处的摩尔吸光值（6.3Lmmol-1·cm-1）；比色血液体总体积（3.240mL）；比色皿中滤液的体积，单位为毫升（mL）；比色皿光通路长度（1.00cm）；稀释倍数。
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计算结果保留至小数点后一位。4.2.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的20%。4.2.8检出限
检出限为4.2mg/L
4.3乳果糖/糠氨酸比值的计算bzxZ.net
样品中乳果糖/糠氨酸比值以R计,按式（8)计算R=
计算结果保留至小数点后两位。5
复原乳的鉴定
5.1巴氏杀菌乳
当L<100.0mg/L时，判定如下：
a）当12.0mg/100g蛋白质25.0mg/100g蛋白质时，若R<1.00.则判定为含有复原乳。5.2UHT灭菌乳
当L<600.0mg/L、FT>190.0mg/100g蛋白质时，若R<1.80.则判定为含有复原乳。本文件为参考件
以正式纸质版标准为准
A.1高效液相色谱法(HPLC)色谱图见图A.1~图A.2
附录A
（资料性附录）
糠氨酸液相色谱图
18.0021.00
保留时间（min）
2mg/L糠氨酸标准溶液HPLC色谱图58
保留时间（min）
UHT灭菌乳中糠氨酸测定HPLC色谱图图A.2
A.2超高效液相色谱法(UPLC)色谱图见图A.3~图A.4。
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(nv）
2s8-1-
保留时间（min）
2mg/L糠氨酸标准溶液UPLC色谱图9981-
保留时间（min）
UHT灭菌乳中糠氨酸测定UPLC色谱图5.00
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