NY/T 2962-2016 奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法 NY/T2962-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2962—2016
奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法
Methods for isolation and identification of Staphylococcusaureus,coagulase-negative Staphylococcus and Streptococcusagalactiae in milk from dairy cowwithmastitis2016-10-26发布
2017-04-01实施
中华人民共和国农业部
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所NY/T2962—2016
本标准主要起草人：王旭荣、李宏胜、李建喜、杨峰、王学智、张世栋、李新圃、杨志强、王磊、罗金印NY/T2962—2016
奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法
1范围
本标准规定了奶牛乳房炎乳汁中病原性金黄色葡萄球菌、固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌的分离和鉴定方法。
本标准适用于奶牛乳房炎(临床型乳房界和陆B房的病原菌诊断。所分离的病原菌可进一步SHING
，为奶牛乳房更的治疗
开展药物敏感性检测
规范性引用文
文作商应用是必
下列文件
文件网
凡是注口期的引用
不可少的
注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的人用
文件其最新版本（包括所有的修代单）适用）本件
验室用水规格和试验方法
实验室
生物安全通用要求
GB19489
3术语和定义
下列术语
文件。
金黄色葡萄球菌
Staphylococcusatereus
一种血浆凝固醇试
SEARCH
金为阳性、革兰染色为阴性的葡葡球病，是引起CENT
凝固酶阴性葡萄球菌
negativeSiaphylococcus,CN
coagulase
一类血浆凝固酶为阴性
兰氏卖
房炎的主要病原菌
膜的常居菌，常见的（CNS
主要包括表皮葡萄球菌溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、路邓葡萄球菌葡萄球菌、产色葡萄球菌、鸡
直、松鼠
葡萄球菌、沃氏葡萄球菌等20多种3.3
无乳链球菌Streptococusagalactiae种CAMP试验为阳性、革兰巢色为阳性3.4
CAMP试验CAMPtest
理球菌，
引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一CAMP是Christie，Atkins，Munch-Peterson等人名的缩写，因本试验是他们三人所创建。CAMP试验的原理是原来不溶血或溶血不明显的无乳链球菌，在有金黄色前萄球菌产物存在时.呈明显的3型溶血，可区分无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌。在本标准中，用于无乳链球菌的鉴定。3.5
nuc基因thermonucleasegene
耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌的一种毒力因子，100℃作用15min不失去活性，一般由效病菌产生。nuc基因是编码耐热核酸酶的基因序列,在本标准中，nuc基因用于金黄色葡萄球菌的PCR鉴定。NY/T2962—2016
sip 基因surface immunogenic protein genesip蛋白是无乳链球菌的一种表面免疫相关蛋白，是暴露在菌体表面的一种具有黏附和定植作用的因子。si功基因是编码sip蛋白的基因序列，基因序列保守。在本标准中，sip基因用于无乳链球菌的PCR鉴定。
4采样前检查
4.1总则
在采集乳样前·首先对乳房外观和乳汁性状进行观察2临床型乳房炎的检查
临床型乳房炎的检查至少包括以下5个方面：乳房的小颜色，对称性和硬度
乳房是否有发红、肿胀和发热；触摸时奶牛是否有疼痛反应及有无外伤或瘘管：b)
乳汁的气味和颜色；
d）乳汁有无絮片、凝块；
e）奶产量的变化，
4.3临床型乳房炎的判定
奶牛乳区出现红、肿、热、痛或乳汁性状改变（乳汁颜色改变，或乳汁呈水样或有絮状或有乳凝块或血乳)等症状，则可判定为临床型乳房炎4.4隐性乳房炎的检查与判定
隐性乳房炎可参照NY/T2692的规定进行检验判定，也可用商品化的隐性乳房炎诊断试剂进行检验判定。
5奶牛乳房炎病牛乳样的采集
5.1试剂与材料
乳样采集管：配制方法见A.1；生物冰袋或冰块。5.2
2操作方法
先用温水清洗乳房，然后依次用0.2%新洁尔灭浸泡的脱脂棉或纱布、75%酒精棉擦拭消毒乳头。每个乳头弃去初始2把～3把奶.然后按无菌操作规程分别采集每个乳室的乳样约5mL。采集的乳样保存于乳样采集管中，立即检验。如需运输送检，在运输过程中加入生物冰袋或冰块使乳样温度保持在2℃8℃.并保证在10d以内送到相关实验室。5.3样品记录
样品记录至少应包括以下4项内容：a）送检人的姓名和奶牛场的名称或地址；b）牛号和乳室：
c）采样口期；
d）送检日期。
5.4乳样中的细菌分离鉴定流程
奶牛乳房炎乳样中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定流程图见附录B。6乳样接种和增菌
6.1器材和设备
NY/T2962—2016
恒温培养箱（37℃）、冰箱（4℃）、洁净工作台、pH计、接种环、天平（精度为0.01g）。6.2试剂与材料
血琼脂平板、改良营养肉汤（配制方法见A.2)。6.3操作方法
将待检乳样摇勾：无菌操作，用接种环取2环3环待检乳样，间断划线接种于血琼脂平板上，置37℃恒温培养箱中培养18h～24h，观察细菌生长情况。对培养18h～24h无细菌生长的血琼脂平板，培养时间延长至48h。若血琼脂平板上仍无菌落生长.则取该乳样50uL.接种到改良营养肉汤中进行增菌培养.培养18h~24h。然后，将增菌培养物间断划线接种于新的血琼脂平板上，培养24h~48h，再观察细菌生长情况。
6.4结果判定
乳样在血琼脂平板上接种培养18h48h，如肉眼观察到菌落，则判定乳样中有细菌，然后对血平板上生长的菌落按照第7章的规定进行初步鉴定。增菌培养物在血琼脂平板上接种培养24h~48h，如肉眼观察到菌落，则判定乳样中有细菌，然后对血琼脂平板上生长的菌落按照第7章的规定进行初步鉴定；如培养至48h仍无细菌生长，则判定乳样中无细菌。
7初步鉴定
7.1器材和设备
光学显微镜、恒温培养箱（37℃）、洁净工作台、冰箱（4℃）、pH计、接种环、天平（精度为0.01g）。7.2试剂与材料
革兰氏染色液、血琼脂平板。
7.3菌落观察
肉眼观察血琼脂平板上的菌落。7.4菌落观察结果判定
7.4.1当菌落为圆形、光滑凸起、湿润、边缘整齐，颜色呈金黄色、灰白色、乳白色或柠檬色，直径0.5mm~1.5mm的大菌落，溶血或不溶血，可初步判定为葡萄球菌属。7.4.2当菌落为圆形、光滑凸起、湿润、边缘整齐，颜色为灰白色或毛玻璃色，透明或半透明的小菌落或针尖大小的菌落，α溶血、3溶血或不溶血，可初步判定为链球菌属。7.5革兰氏染色镜检
分别挑取步骤7.4中疑似菌落进行革兰氏染色，将染色菌样置于显微镜油镜下观察7.6革兰氏染色镜检结果判定
如果镜检观察到菌体为革兰氏阳性（G）.形态为圆形或椭圆形，成对状、从状、葡萄串状或链状排列的细菌.初步定为G+球菌。
7.7纯化培养
挑取步骤7.6中初步判定为G球菌的单个菌落，间断划线接种于新的血琼脂平板上，置37℃恒温培养箱中进行纯化培养18h～24h后，再次按7.4、7.5进行判定和革兰氏染色镜检如果镜检为纯净的G球菌，则可进行接触酶试验。纯净的葡萄球菌属细菌镜检观察到菌体为革兰氏阳性（G）.形态为圆形，成对状、丛状或葡菊串状；纯净的链球菌属细菌镜检观察到菌体为革兰氏阳性（G+），形态为圆形或椭圆形，成对状或链状排列。如果不纯净，重复本步骤.直至镜检菌落纯净。7.8属别鉴定
7.8.1总则
对7.7中镜检观察为G球菌的纯净菌落进行接触酶试验3
VY/T2962—2016
7.8.2试验试剂
3%H.O2济液：配制方法见A.3。
7.8.3接触酶试验操作方法
取3%H202溶液1滴~2滴置于干净载玻片上：然后加一接种环被检细菌菌落，与H,O滴液混合，立即产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。7.8.4结果判定wwW.bzxz.Net
G球菌，且接触酶试验阳性（+）.初步判定为葡萄球菌属：G球菌，且接触酶试验阴性（一），初步判定为链球菌属SPUBLISHING
8定性鉴定
8.1凝固酶阴性葡萄球菌的定性鉴定8.1.1总则
萄球菌属
的细菌进行
将步骤7.8.4中
8.1.2器材和设备
恒温培养箱（
8.1.3试剂与材料
8.1.3.1兔血浆
台冰箱下
浆凝固酶
配制方法见
浆也可用商品化的试剂，按说明用A
8.1.3.2阳性对照菌梯
兔血浆凝固酶阳
8.1.3.3阴性对照
打萄球菌菌株。
空白兔血浆
8.1.4兔血浆凝固
酶试验操作方法
5ml放人无菌小试管
取新鲜配置的
0.6mL，震荡摇勺
6h.如呈现凝固（即将试领
阳性结果。
8.1.5结果判定
文倒置时
和人待检细菌
同时设立阳
RESEARCH
性对照和阴性对
或凝周体和大于总体积
出现凝块
葡萄球菌属的细菌，月符合兔血浆凝固酶试验阴性葡萄球菌属的细菌且
免血浆固
8.2金黄色葡萄球菌的定性鉴定
8.2.1Baird-Parker琼脂平板筛选8.2.1.1总则
一，则判定为凝固酶
生（十）则判定为凝固
nL，总体积为
观察一次，观察
二半，则判定为
葡萄球菌；
阳性葡带球菌。
将步骤8.1.5中判定为凝固酶阳性葡萄球菌的细菌进行Baird-Parkcr琼脂平板筛选。8.2.1.2器材和设备
恒温培养箱（37℃）、洁净工作台、冰箱（4℃）。8.2.1.3试剂与材料
BairdParker琼脂平板：配制方法见A.58.2.1.4Baird-Parker琼脂平板筛选操作方法将待检细菌划线接种到Baird-Parker琼脂平板上，置37℃恒温培养箱中培养18h~24h后观察菌落形态。
8.2.1.5Baird-Parker琼脂平板筛选结果判定NY/T2962—2016
如果菌落直径为2mm～3mm.额色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有透明圈，某些菌落混浊带和透明圈不明显，则初步判定为金黄色葡萄球菌。8.2.2金黄色葡萄球菌的聚合酶链式反应（PCR)检测8.2.2.1总则
将8.2.1.5中初步判定为金黄色葡萄球菌的细菌进行PCR检测.预期扩增片段279bp.PCR扩增的核苷酸序列参照附录C。
8.2.2.2器材和设备
JEL/SHING
PCR仪及PCR管、核酸中泳仪、核酸电泳槽及配套的制胶板与制胶梳、紫外凝胶成像系统或其他核酸电泳凝胶成像系统（与对应的核酸染料相适用）冰箱4℃）恒温水浴锅（30℃70℃）、微量移液器SARD
及吸头（量程为0.1l
涡旋仪、天平（精度为0.01g）、医10.0
用乳胶手套和PE手
8.2.2.3试剂与材料
SRESEARCH
8.2.2.3.1
的引物：商业合成
葡萄球菌
序列Y5
GCGATNGATGGTGATACGTT
上游引物
下游引物
8.2.2.3.2
8.2.2.3.3
8.2.2.3.4
8.2.2.3.5
8.2.2.3.6
8.2.2.3.7
8.2.2.3.8
养肉汤。
AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGO
兰氏里
生细菌DNA提取试剂盒
超纯水
酸电泳凝胶成件
8.2.2.3.9
8.2.2.3.10
菌株。
9或者其
商品化
PCR皮应
DL1cooTadder
冰缓冲液：配制力法
溴化乙锭：与茶
我者150bp
系统相适应
胶成像
系统相适应的商品化核酸染料
糖：电
阿性对
制方法贝
葡萄球菌标准菌株或者经鉴定确认黄
8.2.2.3.11阴性对照设置超纯水为阴性对照8.2.2.4操作步骤
8.2.2.4.1
细菌基因组 DNA的提取
者使用与其他核
色葡萄球菌地方分离
将8.2.1.5中初步判定为金黄色葡萄球菌的待检细菌、阳性对照菌株分别在营养肉汤中增菌培养18h～24h达到对数生长期，取对数生长期的细菌增殖菌液1.5mL.按照革兰氏阳性细菌DNA提取试剂盒的说明书的方法和步骤，分别提取待检细菌、阳性对照菌株的细菌总DNA。8.2.2.4.2反应体系
以8.2.2.4.1中提取的细菌总DNA为模板DNA，分别进行金黄色葡萄球菌的nuc基因PCR扩增鉴定。每个样品50.0uL反应体系.组成如下：Premix Taq
（或者其他商品化的PCR反应预混液）超纯水
上游引物nucl(10ommol/L）
下游引物nuc2（100mmol/L）
NY/T2962—2016
模板DVA
总体积
8.2.2.4.3PCR扩增
4.0μL（DNA总量为50ng~120ng）50.0μL
按照8.2.2.4.2中的加样顺序全部加完后.充分混勾，瞬时离心.使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加人一滴液体石蜡油（约20uL）。阳性对照，阴性对照随样品同步进行DNA提取及PCR扩增8.2.2.4.4金黄色葡萄球菌nuc基因的扩增条件第一阶段.95℃预变性5min：第二阶段，94C50s.54℃30s，72℃30s，30个循环：第三阶段.72℃延伸7min；然后将扩增产物按下述进行电泳分析和结果判定或置4℃保存。8.2.2.4.5琼脂糖凝胶的制备
nuc基因的PCR扩增产物需要在浓度为15.0g/L.的琼脂糖凝胶上进行核酸电泳，按A.8的方法制备琼脂糖凝胶。
8.2.2.4.6电泳
PCR扩增结束后，取nuc基因的PCR产物10.0uL在浓度为15.0g/L的琼脂糖凝胶上电泳.在与核酸染料相适应的核酸电泳凝胶成像系统上观察电泳结果。8.2.2.4.7电泳结果判定
在核酸电泳凝胶成像系统下观察，金黄色葡萄球菌nuc基因的扩增片段为279bp，且阳性对照、阴性对照均成立，则判定nuc基因扩增阳性（十）。8.2.3结果判定
如果待鉴定的凝固酶阳性葡萄球菌符合下列2项指标，则判定为金黄色葡萄球菌。a）Baird-Parker平板上菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈，某些菌落混浊带和透明圈不明显；b）金黄色葡萄球菌nuc基因PCR扩增阳性（十）。8.3无乳链球菌的鉴定
8.3.1CAMP试验
8.3.1.1总则
将步骤7.8.4中鉴定为链球菌属的细菌进行CAMP试验，8.3.1.2器材和设备
恒温培养箱（37℃）、洁净工作台、冰箱（4℃）。8.3.1.3试剂与材料
血琼脂平板。
8.3.1.4CAMP试验操作方法
在血琼脂平板上用3溶血性金黄色葡萄球菌培养物划一条直线（竖线）然后用待检细菌培养物分别划一横线，与β溶血性金黄色葡萄球菌线垂直，但不要与之接触，37℃培养20h～~24h判定。在β溶血性金黄色葡萄球菌线于被检菌线形成的直角处，呈现半圆形或三角形的β溶血区，似一个箭头，即为CAMP阳性（十）结果，不溶血者为CAMP阴性（一）结果。8.3.1.5CAMP试验结果判定
链球菌属的细菌：且CAMP试验阳性（十）.则判定疑似无乳链球菌8.3.2无乳链球菌的PCR鉴定
8.3.2.1总则
将步骤8.3.1.5中鉴定疑似无乳链球菌的细菌进行无乳链球菌的PCR鉴定，预期扩增片段13056
bp.PCR扩增的核苷酸序列参照附录D。8.3.2.2器材和设备
同8.2.2.2。
8.3.2.3试验材料
8.3.2.3.1无乳链球菌PCR鉴定的引物序列为：商业合成。上游引物sipl：5'-ATGAAAATGAATAAAAAGGTAC-3'；下游引物$ip2：5'-TTATTTGTTAAATGATACGTG-3。8.3.2.3.2THB肉汤：配制方法见A.9。8.3.2.3.3革兰氏阳性细菌DNA提取试剂盒8.3.2.3.4PremixTag或者其他商品化的PCR反应预混液8.3.2.3.5超纯水。
8.3.2.3.6DNA Ladder:DL2000Ladder。8.3.2.3.7琼脂糖：电泳级。
8.3.2.3.81XTAE电泳缓冲液：配制方法见A.7。NY/T2962—2016
8.3.2.3.910mg/mL溴化乙锭：与紫外凝胶成像系统相适应，配制方法见A.8。或者使用与其他核酸电泳凝胶成像系统相适应的商品化核酸染料。8.3.2.3.10阳性对照菌株：无乳链球菌标准菌株或者鉴定准确的无乳链球菌地方分离菌株。8.3.2.3.11阴性对照：阴性对照是超纯水，8.3.2.4操作步骤
8.3.2.4.1细菌基因组DNA的提取将8.3.1.5中疑似无乳链球菌的细菌、阳性对照菌株分别接种于THB肉汤中增菌培养18h~24h达到对数生长期，取对数生长期的细菌增殖菌液1.5mL，根据革兰氏阳性细菌DNA提取试剂盒说明书分别提取待检细菌、阳性对照菌株的细菌总DNA。8.3.2.4.2反应体系
以8.3.2.4.1中提取的细菌总DNA为模板DNA，分别进行无乳链球菌的siP基因PCR扩增鉴定。每个样品的50.0uL反应体系，组成如下：Premix Taq
（或者其他商品化的PCR反应预混液）超纯水
上游引物sip1（100mmol/1.）
下游引物sip2（100mmol/L）
模板DNA
总体积
8.3.2.4.3PCR扩增
4.0μL（DNA总量为50ng120ng）50.0μl
按照8.3.2.4.2加样顺序全部加完后，充分混勾，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入一滴液体石蜡油（约20L）。阳性对照、阴性对照随样品同步进行DNA提取及PCR扩增。8.3.2.4.4无乳链球菌sip基因的循环条件第一阶段.95℃预变性5min；第二阶段，94℃60s，45℃90s，72℃90s.30个循环；第三阶段，72℃延仲10min然后将扩增产物按下述进行电泳分析和结果判定或置4C保存：8.3.2.4.5琼脂糖凝胶的制备
NY/T2962—2016
sip基因的PCR扩增产物需要在浓度为10.0g/L的琼脂糖凝胶工进行核酸电泳。按A.9的方法制备琼脂糖凝胶
8.3.2.4.6电泳
PCR扩增结束后.取sip基因的PCR产物10.0aL在10.0g/L的琼脂糖凝胶上电泳，在与核酸染料相适应的核酸电泳凝胶成像系统上观察电泳结果。8.3.2.4.7电泳结果判定
在核酸电泳凝胶成像系统下观察.无乳链球菌sip基因扩增片段为1305bp.且阳性对照、阴性对照均成立，则判定sip基因扩增阳性（十）。8.3.3结果判定
LSTANDARD
BLISHING
如果待鉴定的疑是无乳链球菌的细菌。工无乳链球PU
链球菌。
基因PCR扩增阳性（+），则判定为无乳GRESEARCPOENIE
A.1乳样采集管
A.1.1成分
蛋山陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
养琼脂，按照计
分装人
菌完成后拧
注：确保孚
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
PUBLISHINGA
STANDARD
NY/T2962—2016
GEARONORNE
明书操
烧杯电·搅持加热者沸至完全滑国平底塑料试管中每管
清成斜面培杂基·琼脂
同即市
改良营
养肉汤
牛肉膏
胰蛋白
酵母浸出物
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
将A.2.1试剂放
人烧杯中，搅拌加
鑫调节PH
一但不能打
完全溶解
调节pH
管2mL。121℃高压灭菌15min，冷却后4C保存备用使用前40pL
3%H,02溶液
A.3.1制法
也可用商品化的营
高压灭菌20min。灭
2-~7.4，分装入坡璃试管，每
管加入50%葡菊糖40uL、特牛血清吸取1mL30%HO溶液.溶于9mL蒸馏水中，搭勾，即可使用。A.4兔血浆
制法：取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100mL，溶解后过滤，瓶装，121℃高压火菌15min。无菌取3.8%柠檬酸钠济液1份.加健康兔全血4份.轻轻摇勾，静置或3000r/min离心30min，使血细胞沉降，即可得到血浆，经细菌培养检验为阴性，即可使用，也可用商品化的免血浆，按照说明书操作
NY/T2962—2016
5Baird-Parker琼脂平板
A.5.1成分
胰蛋白陈
牛肉膏
酵母膏
丙酮酸钠
甘氨酸
氯化锂
蒸馏水
A.5.2增菌剂的配法
30%卵黄盐水50mL与经过过滤除菌的1%亚碲酸钾10mL混合.保存于冰箱（2℃~8℃）内。A.5.3制法
将各成分加人到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.0土0.2。分装每瓶95mL，121C高压灭菌15min。临时用加热融化琼脂，冷至47℃~50℃，每95mlBaird-Parker琼脂基础培养基加人预热至47℃~50℃的卵黄亚碲酸铆增菌剂5ml，摇勾后倾注平板。培养基应是紧效不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h，也可用商品化的Baird-Parker琼脂基础培养基，按照说明书操作。A.61×TAE电泳缓冲液
A.6.150×TAE电泳缓冲液成分
Na2EDTA·2H,O
A.6.2制法
分别称取上述成分，在800mL去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1mL的醋酸，充分搅拌，然后加去离子水将溶液定容至1000mL，空温保存备用。将50XTAE电泳缓冲液进行50倍稀释则为制备琼脂糖凝胶和核酸电泳的1XTAE电泳缓冲液。A.7溴化乙锭（10mg/mL）
制法：称取0.1g况化乙锭，加人到洁净的15mL塑料螺口离心管中.加入10mL灭菌的去离子水充分搅拌使溴化乙锭完全溶解，将溶液室温避光保存。溴化乙锭的工作浓度为0.5ug/ml。注：溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并具有中毒毒性，要小心操作，带医用乳胶手套或PE手套A.8琼脂糖凝胶
制法：
a）根据样品数量的多少和电泳槽选择制胶板的大小，并决定琼脂糖凝胶的需用量b）将配套的制胶梳安置到制胶板上。然后称取需用量的琼脂糖，加入到三角瓶中.加人相应量的电泳缓冲液（见A，7），在微波炉中c
加热融化。
d）冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度（见A.8）。或者使用其他商品化的核酸染料，按其说明书使用。
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