备案号：18619-2006 江西省地方标准 DB36/T 484—2005 饲料中沙丁胺醇的测定——酶联免疫吸附法 2005-12-25发布 2006-02-01实施 江西省质量技术监督局发布 目 次 前言 1 范围 2 方法原理 3 试剂和材料 4 仪器设备 5 样品的制备 6 分析步骤 7 结果计算 8 灵敏度 9 其他 前言 本标准由江西省农业厅提出。 本标准起草单位：江西省兽药饲料监察所。 本标准起草人：文虹、周华娇、符金华、饶辉、尹腾桂、周伟良。 1 范围 本标准规定了饲料中沙丁胺醇酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。 本标准适用于配（混）合饲料、浓缩饲料、预混合饲料及饲料添加剂中沙丁胺醇的测定。 2 方法原理 利用固相酶联免疫吸附原理，将沙丁胺醇特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入稀释的样品（未知抗原）及酶标沙丁胺醇抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争反应。然后加入酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标沙丁胺醇抗原结合的量，即样品中沙丁胺醇多，则被抗体结合的酶标沙丁胺醇少，颜色浅，反之则深。用目测法或仪器法与沙丁胺醇标样比较来判断样品中沙丁胺醇的含量。 3 试剂和材料 以下试剂除特别注明外均为分析纯，水为蒸馏水。 3.1 沙丁胺醇酶联免疫试剂盒 3.1.1 1×96孔板（12条×8孔），包被有抗沙丁胺醇的IgG抗体。 3.1.2 6×标准液（2 mL），分别含0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb的SAL溶液。 3.1.3 1×SAL过氧化物酶标记物浓缩溶液。 3.1.4 1×酶反应底物（7 mL）：含有过氧化尿素。 3.1.5 1×显色剂（7 mL）：四甲基联苯胺。 3.1.6 1×反应停止液（8 mL）：1N盐酸。 3.1.7 1×PBS（15 mL），用于稀释SAL-过氧化物酶标记物浓缩溶液。 3.1.8 1×PBST浓缩液（40 mL），加800 mL蒸馏水稀释后用于洗板。 3.2 2 mol/L盐酸。 3.3 1 mol/L氢氧化钠。 4 仪器设备 4.1 实验室常用仪器设备。 4.2 酶标测定仪，含有450 nm滤光片。 4.3 振荡器：振荡频率100次/min（往复）。 4.4 离心机，转速可达4000 rpm。 4.5 微量连续可调移液器及配套吸头（10～300 μL）。 5 样品的制备 5.1 取具有代表性的饲料样品，用四分法缩减至约200 g，粉碎并过0.45 mm孔径筛，充分混匀后装入磨口瓶备用。 6 分析步骤 6.1 提取 称取样品2 g（精确至0.01 g），置于50 mL试管中，加入2 mL 1 mol/L HCl及16 mL蒸馏水混匀，振荡15 min，然后以4000 rpm离心20 min，转移上清液并加入1 mol/L NaOH调节pH至6.5～7.5，静置15 min后再次以4000 rpm离心20 min，取上清液备用。 6.2 测定 6.2.1 试剂盒和待测样品在检测前应平衡至室温（20 ℃～25 ℃）。 6.2.2 将足够标准和样品所需的孔条插入微孔架，标准和样品均做平行试验，记录位置。倒出孔内抗体液，用稀释后的PBST洗涤3次，每次加洗液后静置2 min再倒掉。 6.2.3 各微孔中加入50 μL标准液或处理后的样品。 6.2.4 加入100 μL稀释后的酶标记物，在25 ℃～30 ℃孵育30 min，倒出孔内液体，用250 μL稀释后的PBST洗涤3次，每次加洗液后静置2 min再倒掉。 6.2.5 将反应物与显色剂按1:1混合后加入100 μL于微孔中，充分混合并在25 ℃～30 ℃避光条件下孵育15 min。 6.2.6 加入50 μL反应停止液，在10 min内读取吸光度值。 7 结果计算 7.1 将标准和样品的吸光度值及其平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，得到吸光度百分比，即0标准为100%。 计算公式：标准（或样品）吸光度值 ÷ 0标准吸光度值 × 100 = 吸光度百分比。 7.2 将标准值绘制成对应沙丁胺醇浓度（ng/g或ng/mL）的半对数坐标曲线图，校正曲线在0.3～2.7 ng/g（ppb）范围内应呈线性。由校正曲线可读出各样品的浓度。 7.3 以0.9 ng/g的标准孔为对照孔，样品吸光度值小于该孔吸光度值的判定为可疑阳性。 8 灵敏度 本方法的检测限为0.1 ng/g。 9 其他 9.1 试剂盒应保存在2 ℃～8 ℃冰箱内。 9.2 操作时应佩戴医用乳胶手套，以确保人员安全。 9.3 本方法检出的可疑阳性样品必须采用GC-MS法进一步确证。