GB/T 38483-2020.Determination of antibacterial activity for microbial secondary metabolites-Inhibition zone method.
1范围
GB/T 38483规定了用抑菌圈法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性的方法。
GB/T 38483适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室 生物安全要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
抑制中浓度 median inhibitory concentration
IC50
对细菌的抑制率达到50%时的浓度。
3.2
抗细菌活性 antibacterial activity
抑制细菌生长繁殖的能力。
3.3
抑菌圈 inhibition zone
固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域。
4原理
利用待测次生代谢产物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制形成的抑菌圈大小,计算IC50来判定活性。
5实验室生物安全要求
应符合GB 19489的规定。
6试剂或材料
除非另有规定,所用试剂均为分析纯。
6.1 水。GB/T 6682 一级水。
6.2 LB液体培养基。称取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g.氯化钠10.0 g,然后将上述各成分加于1 000 mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0士0.2,分装至锥形瓶中,121 ℃灭菌20 min。
6.3 LB固体培养基。称取胰蛋白胨10.0 g.酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂20.0 g,然后将上述各成分加于1000 mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0士0.2,分装至250 mL锥形瓶中,121 °C灭菌20 min。
本标准规定了用抑菌圈法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性的方法。 本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38483—2020
微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法
Determination of antibacterial activity for microbial secondarymetabolites-Inhibition zone method2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-19实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院本标准主要起草人：申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、许益鹏、崔海峰、张雅芬Sa
GB/T38483—2020
1范围
微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定
抑菌圈法
GB/T38483—2020
本标准规定了用抑菌圈法测定微生物源抗牛素类次牛代谢产物抗细菌活性的方法。本标准适用干微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定。2规范性引用文件
下列文件对干本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用干本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
抑制中浓度
median inhibitory concentration对细菌的抑制率达到50%时的浓度3.2
抗细菌活性
antibacterial activity
抑制细菌生长繁殖的能力。
抑菌圈bzxz.net
inhibition zone
固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域。4原理
利用待测次生代谢产物在琼脂平板中扩散使其周用的细菌生长受到抑制形成的抑菌圈大小，计算ICso来判定活性。
实验室生物安全要求
应符合GB19489的规定。
试剂或材料
除非另有规定，所用试剂均为分析纯。1
GB/T38483—2020
6.1水。GB/T6682一级水。
6.2LB液体培养基。称取胰蛋白陈10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g，然后将上.述各成分加于1000mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至锥形瓶中，121℃灭菌20min。6.3LB固体培养基。称取胰蛋白陈10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20.0g，然后将上述各成分加于1000mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0士0.2，分装至250mL锥形瓶中，121℃灭菌20min。
6.4指示菌标准菌株：
革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCc6538。革兰氏阴性菌：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli)ATCC11229。也可以采用其他标准菌株作为供试菌，具体可参照实际情况进行选择。7仪器设备
恒温培养箱：温度偏差在士1℃以内。无菌培养皿：带陶瓦盖，直径90mm。7.3无菌牛津杯：不锈钢，标准规格：内径6mm、外径8mm、高10mm。7.4抑菌圈测量仪：精度0.1mm。分光光度计：检测波长600nm。
无菌锥形瓶：容量100mL、250mL。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器。8
操作步骤
菌株活化
将菌株接种到装有2mL的LB液体培养基的试管中，37℃土1℃下培养12h～18h。用接种环挑取菌悬液以划线法接种到LB固体平板上，37℃土1℃恒温培养箱中培养18h24h，然后从平板中挑取单菌落接种在LB固体培养基试管斜面内，37℃土1℃恒温培养箱中培养18h～24h，后将试管斜面贮存干1℃～4℃冰箱内作为保存菌，保存期不超过一个月，每月传代一次，传代次数不超过10代。8.2菌悬液制备
8.2.1用接种环取保存菌，以划线法接种到LB固体平板上,37℃土1℃下培养24h。注：LB固体平板在1℃~4℃条件下保存，1周内使用。8.2.2取LB液体培养基20mL加容量为100mL的无菌锥形瓶内，用接种环取8.2.1平皿上的单菌落接种在LB液体培养基内，37℃士1℃培养12h18h。8.2.3用LB液体培养基调节培养后的菌浓度至1X10°CFU/mL～5×10\CFU/mL并以此作为试验菌悬液。采用分光光度计测定试验菌悬液ODoo为0.5～0.65或（其他)适当的方法测定菌悬液浓度。注：试验菌悬液在1℃～4℃条件下保存，在4h内使用。8.3供试样品制备
极性样品直接用水充分溶解（非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解），配制成一定浓度的母液，经无菌0.45μm滤膜过滤，然后用无菌水（或相应的表面活性剂)按2倍或5倍浓度逐级稀释，制备成至少5个不同浓度的待测溶液；逐级稀释时应确保既有抑制率大于50%分布的浓度点，也有抑制率小干50%分布的浓度点，现配现用。2
8.4检测平板制备
GB/T38483—2020
将8.2.3中的菌悬液用冷却至55℃左右的LB固体培养基按1：10的比例稀释，充分混匀后取15mL于无菌培养皿内，轻轻播动平板使菌液均勾铺平，待其凝固后制成检测平板，备用。5抑菌活性测定
分别将无菌牛津杯轻轻地放在8.4制备的检测平板中，而后用无菌吸管分别将8.3中制备的200μL不同浓度的供试样品溶液加人牛津杯中，空白对照组加人200μL对应的溶剂，每个处理重复5次。将平板正置干37℃土1℃恒温培养箱中培养12h～18h，取出，用抑菌圈测量仪测量待测样品和空白对照组形成的抑菌圈直径。
结果计算
抑制率按式(1)计算：
式中：
I—抑制率；
×100%
D，—一供试次代谢产物平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm)；D——空白对照平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。以五个平行样的平均值为最终结果，计算结果保留到小数点后两位。根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析，得到回归曲线Y=aX十b,其中Y为抑制率的概率值，X为药剂浓度对数值，a为回归曲线斜率，b为常数，并给出回归曲线的R2值，计算供试药剂分别对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的IC5o值。10
重复性
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15%。
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