YY/T 1434-2016.Medical devices for human in vitro assisted reproductive technology-In vitro mouse embryo assay.
4.3.1.2对照组准备
a)阳性对 照组
所使用的阳性对照品应经方法学验证,证实其在规定的使用方法和使用剂量下能够产生有统计学意义的胚胎毒性。
b)阴性对 照组
阴性对照组使用M2、M16培养液。
注:试验中使用的所有与胚胎接触的培养液和耗材都应是已经通过鼠胚试验检测的产品.
4.3.2试验程序
4.3.2.1超数排卵
选择6周齡~8周齡離鼠,经腹腔注射PMSG 10 IU/只;48 h后经腹腔注射hCG 10 IU/只,注射hCG当日雄鼠与同品系雄鼠合笼过夜。
4.3.2.2准备培养皿
培养胚胎前在细胞培养皿中制备- - 定数量30 μL~50 μL大小的液体微滴(培养液) ,表面覆盖培养用油,在CO:培养箱内预平衡4 h~18 h.
4.3.2.3鼠胚采集
合笼第二天早.上检查交配情况,选择见栓小鼠备用。
a) 1-细胞胚胎收集:注射hCG后18 h~22 h后处死见栓雌鼠,在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎.将收集到的絮状受精卵团放置到37 C提前预热好的透明质酸酶中,当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移、清洗后,挑选出正常形态的受精胚胎,转移到培养微滴中,用于1-细胞鼠胚检测试验。
b) 2-细胞胚胎收集:注射bCG后40 h~48h后,处死见栓離鼠。用显微镊将输卵管末端(输卵管伞)套.上冲胚针,用培养液将胚胎从输卵管中冲洗出来,收集到的2-细胞胚胎经冲洗后用于2-细胞鼠胚检测试验.
4.3.2.4体外培养
采用微滴法培养,将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组,置于已平衡的培养液(见4.3.2.2)中,于37 C ,5%或6% CO2 ,饱和湿度的培养箱中培养。每组鼠胚数不少于50个。
注1;每组试验鼠胚来自3只~5只小鼠,将每只孕鼠的胚胎随机分配到各试验组进行试验。建议每个微满中超