ICS 65.020.01
CCS B 36
DB52
贵州省地方标准
DB52/T 1528—2020

紫苏品种鉴定技术规程
SSR标记法

2020-11-13 发布
2021-03-01 实施
贵州省市场监督管理局 发布

前言

本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由贵州省农业农村厅提出并归口。
本文件起草单位：贵州省油菜研究所。
本文件主要起草人：沈奇、温贺、王仙萍、徐静、商志伟、杨森、杜才富、陈俊琨、田飞、汤勇。

1 范围

本文件规定了利用SSR标记法进行紫苏品种鉴定的术语和定义、原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、参照品种准备、操作步骤、数据记录与统计、结果判定。
本文件适用于紫苏品种资源的鉴定与评价。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 23768 紫苏

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。
3.1
SSR标记 simple sequence repeat marker
又称微卫星DNA标记，是指基因组中串联重复的短序列，其重复单元长度通常为1～6个碱基对，具有多态性丰富、共显性遗传等特性。
3.2
紫苏 perilla
唇形科紫苏属一年生草本植物，学名Perilla frutescens (L.) Britt.，包括白苏、紫苏、赤苏等变种。

4 原理

利用PCR技术扩增紫苏基因组中的SSR位点，通过电泳分离不同长度的DNA片段，根据条带的位置和数量差异进行品种鉴定。

5 仪器设备及试剂

5.1 仪器设备
5.1.1 超微量分光光度计
5.1.2 低温高速离心机
5.1.3 恒温金属浴
5.1.4 凝胶成像系统
5.1.5 电泳仪及电泳槽
5.1.6 PCR仪
5.1.7 移液器（10 μL、100 μL、1000 μL）
5.1.8 电子天平（精度0.1 mg）
5.1.9 超纯水机
5.2 主要试剂
5.2.1 无水乙醇
5.2.2 异丙醇
5.2.3 三氯乙酸（分析纯）
5.2.4 乙酸钠（分析纯）
5.2.5 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，分析纯）
5.2.6 氯化钠（分析纯）
5.2.7 苯酚（分析纯）
5.2.8 氯仿（分析纯）
5.2.9 去污剂SDS
5.2.10 溴化乙锭（EB）或凝胶绿
5.2.11 DNA分子量标准
5.2.12 10×PCR缓冲液
5.2.13 dNTPs（各2.5 mmol/L）
5.2.14 Taq DNA聚合酶（5 U/μL）
5.2.15 引物（见附录C）
5.2.16 去离子水（ddH₂O）

6 溶液配制

6.1 CTAB提取液
称取CTAB 20 g，NaCl 12 g，Tris-HCl（pH 8.0）50 g，EDTA（pH 8.0）20 g，溶于500 mL去离子水中，加入500 mL无水乙醇，混匀，4 ℃保存。
6.2 75%乙醇
量取150 mL无水乙醇，加入50 mL去离子水，混匀。
6.3 TE洗脱液
量取10 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），加入1 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），用去离子水定容至100 mL。
6.4 1%琼脂糖凝胶
称取1.0 g琼脂糖，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热溶解，冷却至60 ℃左右加入溴化乙锭（终浓度0.5 μg/mL），混匀后倒入模具，待凝固后取出。

7 引物信息

推荐使用的SSR引物名单及序列见附录C。

8 参照品种准备

8.1 参照品种
选取经过鉴定的紫苏品种资源作为参照品种，参照品种名单见附录D。
8.2 DNA提取
8.2.1 材料准备
取参照品种及待鉴定制品种的健康嫩叶0.5 g～1.0 g，剪碎，放入预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末。
8.2.2 裂解
将粉末转移至1.5 mL离心管中，加入600 μL预热的CTAB提取液（65 ℃），轻轻颠倒混匀，65 ℃水浴30 min，每10 min轻摇一次。
8.2.3 抽提
取出离心管，冰浴10 min，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻柔混匀，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，吸取上清液至新离心管中。
8.2.4 沉淀
向含有上清液的离心管中加入2/1体积的预冷无水乙醇，-20 ℃沉淀30 min以上，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清。
8.2.5 洗涤
用预冷的75%乙醇洗涤沉淀2次，每次12000 r/min离心5 min，弃上清，室温晾干沉淀。
8.2.6 溶解
加入50 μL TE洗脱液，65 ℃水浴15 min，混匀，-20 ℃保存备用。
8.3 待鉴定制品种
参照8.2方法提取待鉴定制品种的基因组DNA。

9 操作步骤

9.1 PCR扩增
9.1.1 反应体系（总体积25 μL）
10×PCR缓冲液 2.5 μL
dNTPs 2.0 μL
上游引物（10 μmol/L） 1.0 μL
下游引物（10 μmol/L） 1.0 μL
Taq DNA聚合酶 1.0 μL
模板DNA（10～50 ng） 1.0 μL
ddH₂O 补至25.0 μL
9.1.2 PCR程序
95 ℃ 预变性 5 min
95 ℃ 变性 30 s
50～60 ℃ 退火 30 s
72 ℃ 延伸 60 s
30～35个循环
72 ℃ 终延伸 10 min
4 ℃ 保存

9.2 琼脂糖凝胶电泳
9.2.1 制备1%琼脂糖凝胶。
9.2.2 每孔加入5 μL PCR产物，同时加入1 μL上样缓冲液和5 μL DNA分子量标准。
9.2.3 在1×TAE电泳缓冲液中，以5 V/cm的电压电泳30～45 min。
9.2.4 电泳结束后，在凝胶成像系统中观察并拍照。

10 数据记录与统计

10.1 记录各品种在每个SSR位点的条带位置及大小。
10.2 统计各品种在每个SSR位点的等位基因型。

11 结果判定

11.1 将待鉴定制品种的SSR图谱与参照品种的SSR图谱进行比较。
11.2 若待鉴定制品种在所有测试SSR位点上的基因型与某一参照品种完全一致，则判定为同一品种。
11.3 若存在一个或多个位点差异，则判定为不同品种或需进一步鉴定。
11.4 参照品种等位变异位点信息见附录E。

附录A（资料性）主要仪器设备及试剂

（此处列出主要仪器设备的品牌型号及试剂的规格，具体参数根据实际采购情况填写，略）

附录B（资料性）溶液配制

（此处详细列出各缓冲液的配制方法及步骤，略）

附录C（资料性）推荐引物名单及序列

（此处列出推荐的SSR引物名称、序列、扩增产物大小等信息，略）

附录D（资料性）参照品种名单

（此处列出用于鉴定的紫苏参照品种名称、来源等信息，略）

附录E（资料性）参照品种等位变异位点

（此处列出各参照品种在推荐SSR位点的等位基因型数据，略）