本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 GB/T 4789.30-2003 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T4789.30-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.30-—2003
代替GB/T4789.30—-1994
食品卫生微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
Microbiological examination of food hygieneExamination of Listeria monocytogenes2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T4789.30—2003
本标准对GB/T4789.30--1994《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行修订。
本标准与GB/T4789.30-1994相比主要修改如下：-按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。-修改和规范原标准中的“设备和材料”。培养基成分的含量：A.4.1氮化钠5g改为20g。-对6.8小鼠的致病力试验作了修改。本标准自实施之日起，GB/T4789.30--1994同时废止。本标准的附录A是规范性附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：白竟玉、付萍、李志刚、计融。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。240
1范围
食品卫生微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2规范性引用文件
GB/T4789.30—2003
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料
3.1冰箱：4℃~-20℃。
3.2恒温培养箱：30℃士1℃、24℃±1℃。3.3恒温水浴锅：46℃士1℃。
3.4均质器或灭菌乳钵。
3.5显微镜：10×~100X。
离心机：4000r/min。
3.7架盘药物天平：0g~500g，精度0.5g。3.8锥形瓶：100mL、500mL。
3.9灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。3.10
灭菌平Ⅲ：直径90cm。
灭菌试管：16mm×160mm。
离心管：30mmX100mm。
灭菌注射器：1mL。
单核细胞增生李斯特氏菌标准株。马红球菌。
5小白鼠：16g~18g。
4培养基和试剂
4.1含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE：见第A.1章。4.2含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA-YE)：见第A.2章。4.3EB增菌液：见第A.3章。
4.4李氏增菌液（LB,，LB）；见第A.4章。4.5三糖铁（TSI)琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.26、4.27。4.6SIM动力培养基：见第A.5章。血琼脂：GB/T4789.28—2003中4.6。4.7
GB/T4789.30—2003
4.8改良的McBride(MMA)琼脂：见第A.5章。4.9硝酸盐培养基：GB/T4789.28一2003中3.17。4.10缓冲葡萄糖蛋白陈水（MR和VP试验用）：GB/T4789.282003中3.4。4.11糖发酵培养基：GB/T4789.28—2003中3.2。4.12过氧化氢酶试验：GB/T4789.28—2003中4.38。4.131%盐酸丫啶黄溶液（AcriflavineHCI)：见第A.4.2.1章。4.141%萘啶酮酸钠盐溶液（Naladixicacid）：见第A.4.2.1章。5检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。检样25g（mL）
分离培养
纯培养
苯兰氏染色
显微嵌下
观察运动
EB增萄液225ml
30℃,48h
SIM动力培养基
选挥性结养基（MMA）
30c.24h48h
2d~5d（伞状）
TSA-YE培养基
30,24h
过轨化氢酵试验
LB,增萄液225mL
30c24h
LB增菌液10mL
30℃.24h
TS琼脂
假致病力试
6操作步骤
6.1样品的收集及处理
GB/T4789.30—2003
无菌取样品25g（mL）放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
-6.2增菌培养
EB增菌液放30℃士1℃培养48h，LB增菌液225mL放30℃士1℃培养24h，吸取0.1mL，加人10mLLB,增菌液中二次增菌。
6.3分离培养
将EB增菌液和LBz二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30℃士1℃48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TSI琼脂和SIM动力培养基，培养于25℃士1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。般观察2d～7d，阳性者可做下一步鉴定。6.5纯培养
将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪陈大豆琼脂培养基(TSA-YE)上纯培养，做以下鉴定。6.6染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查：李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为(0.4μm~0.5μm)×（0.5um2.0μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。6.7生化特性
将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别见表1。
表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别菌种
单核细胞增生李斯特氏菌
(L. monocytogenes)
绵羊李斯特氏菌
(L.ivanovii)
英诺克李斯特氏菌
(L.innocua)
威尔斯李斯特氏菌
(L, rwelshimeri)
西尔李斯特氏菌bzxz.net
(L, seeligeri)
格氏李斯特氏菌
(L.grayi)
默氏李斯特氏菌
(L.murrayi)
溶血反应硝酸盐还原
注：V反应不定，十阳性，一阴性。尿素酶
甘露醇
殿李糖
七叶苔
GB/T4789.30--2003
对小鼠的毒力试验
将符合上述特性的纯培养物接种于TSBYE中，30℃培养24h，离心，弃上清液，用0.85%灭菌生理盐水制备成浓度为101°cfu/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只～5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2d～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌（L.iuanovii)对小鼠有致病性6.9协同溶血试验(cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌（R.equi），在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，30℃培养24h～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌（L.seeligeri）的溶血也增强，而绵羊季斯特氏菌(L.ivanovii)在马红球菌附近的溶血增强。244
附录A
（规范性附录）
培养基
含0.6%酵母浸套的胰酪陈大豆肉汤（TSB-YE）A.1.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
1000mL
GB/T4789.30—2003
A.1.2制法
将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2~7.4，分装，121℃灭菌15min，备用。A.2含0.6%酵母膏胰酪陈大豆琼脂（TSA-YE)A.2.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
A.2.2制法
1000mL
将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌，备用。A.3EB增菌液
A.3.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
盐酸丫啶黄
1000mL
15mg/L
GB/T4789.30—2003
紫啶酮酸
A.3.2制法
40mg/L
除萘啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合，调pH至7.2～7.4,121℃15min高压灭菌。使用前加丫啶黄溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。A.4李氏增菌液（LB1LB,）
A.4.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
七叶苷
蒸馏水
A.4.2制法
1000mL
将上述成分加热溶解，调pH至7.2~7.4，分装，121℃15min高压灭菌。A.4.2.1李氏I液（LB）225mL中加人：1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.45mL
1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馅水配制）A4.2.2李氏Ⅱ液（LB,)200mL中加入：1%萘啶酮酸
1%丫啶黄
无菌分装于10mL大试管中。
A.5改良的McBride琼脂（MMA)
A.5.1成分
牛肉膏
葡萄糖
氯化钠
磷酸氢二钠
苯乙醇
无水甘氨酸
氯化锂
蒸馏水
A.5.2制法
1000mL
将上述成分加热搅拌混匀，调pH至7.2～7.4，分装，121℃15min高压灭菌，备用。246
A.6、SIM动力培养基
A.6.1成分
多价陈
硫酸铁铵
硫代硫酸钠
蒸馏水
A.6.2制法
1000mL
将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌121℃15min。GB/T4789.30—2003
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