河南省地方标准 DB41/T1525—2018《猪圆环病毒II型实时荧光PCR检测方法》发布于2018年1月3日，由河南省质量技术监督局于2018年4月3日实施。本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草，主要由河南省畜牧局提出，河南省动物疫病预防控制中心等单位参与起草。本标准的起草人包括班付国、闫若潜、王翠、谢彩华等。本标准适用于对疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等组织样品及血液样品中病毒核酸的检测。 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒II型（PCV2）实时荧光PCR检测的试剂和仪器设备，样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。 2 试剂和仪器设备 2.1 试剂 2.1.1 组织悬液、消化液I、TE缓冲液（见附录A），以上试剂常温保存。 2.1.2 酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1）、0.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）、1×核酸电泳缓冲液、阿氏液（见附录A），以上试剂4℃保存。 2.1.3 消化液II、阳性对照、阴性对照（见附录A），置-20℃保存。 2.1.4 PCV2实时荧光PCR检测用上、下游引物及探针序列参见附录B。 2.2 仪器设备 实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12000×g以上），二级生物安全柜，恒温水浴锅，2℃～8℃冰箱，-70℃冰箱，组织匀浆器或研钵，单道微量移液器（0.1～0.25μL；0.5μL～10μL；20μL～200μL；100μL～1000μL），真空干燥器（非必备）。 3 样品的采集、处理、存放及运输 3.1 样品的采集及处理 采集疑似PCV2感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、淋巴结及扁桃体等靶组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约0.5g，放入组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，转入无菌Eppendorf管中，在4℃条件下以5000r/min离心10分钟，取上清液转移至新的无菌Eppendorf管中备用。 3.2 血清和抗凝血 采集血液3mL～5mL，待血清析出后吸取至无菌Eppendorf管中；用无菌注射器吸入抗凝剂（阿氏液）2mL～3mL，再采集等量血液，混匀后转入无菌Eppendorf管中。 3.3 存放与运送 采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快送往实验室。样品应在2℃～8℃条件下保存不超过24小时；若超过24小时，应置于低于-20℃冰箱保存，不宜反复冻融。 4 操作方法 4.1 样品DNA的提取 4.1.1 取1.5mL无菌离心管，分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100μL，再加入500μL消化液I和10μL消化液II，反复吸打混匀，置于55℃水浴30分钟至1小时。 4.1.2 加入500μL酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，在4℃条件下以12000r/min离心10分钟。 4.1.3 吸取离心后的上清液，转移至新的1.5mL无菌离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，混匀，室温放置15分钟。 4.1.4 在4℃条件下以12000r/min离心15分钟。轻轻倒去上清液，将离心管倒置吸干液体。 4.1.5 加入700μL 75%乙醇，混匀，再次离心。 4.1.6 重复离心，最终吸干残余液体。 4.1.7 加入10μL TE缓冲液，溶解DNA，2000r/min离心5秒，置于-20℃保存。 4.1.8 DNA的制备可采用上述方法，也可使用商品化的试剂盒。 4.2 实时荧光PCR扩增