ICS 65.020.30
B41
DB13 河北省地方标准

DB13/T 2609-2017
禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法

2017-11-22发布
2017-12-22实施
河北省质量技术监督局发布

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、李丽敏、白云、韩庆安。

1 范围
本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子、发病禽组织及其采集样品培养物中的禽流感病毒与新城疫病毒。

2 缩略语
EB：溴化乙锭（ethidium bromide）
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）
RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）

3 试剂或材料
包括TRIzol RNA提取试剂或市售病毒核酸提取试剂盒、氯仿、异丙醇、75%乙醇、1.0%琼脂糖凝胶、50×TAE缓冲液、溴化乙锭（EB，10 μg/μL）或核酸染料、DEPC处理的灭菌双蒸水、DNA分子量标准（100 bp）、2×Taq Master Mix。
警示：氯仿具有毒性，应在通风条件下操作并佩戴防护用品；EB具有致癌风险，应避免接触皮肤；DEPC具有刺激性，应谨慎操作。

3.1 TRIzol RNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒
3.2 氯仿（三氯甲烷）
3.3 1.0%琼脂糖凝胶（见附录A）
3.4 50×TAE缓冲液（见附录A）
3.5 溴化乙锭或核酸染料（见附录A）
3.6 DEPC处理灭菌双蒸水（见附录A）
3.7 DNA分子量标准（100 bp）
3.8 反转录酶（M-MLV或AMV）
3.9 RNA酶抑制剂
3.10 2×Taq Master Mix（含PCR缓冲液、酶、dNTP等）
3.11 dNTP（2.5 mM）
3.12 引物（见附录B，浓度10 μmol/L）

4 仪器设备
4.1 PCR仪（4.0℃~99.9℃）
4.2 凝胶成像系统
4.3 台式低温高速离心机（16000 r/min）
4.4 电泳仪（50V~120V）
4.5 电泳槽
4.6 冰箱
4.7 微量移液器（0.5 μL~1000 μL）
4.8 水浴锅（室温~100℃）

5 样品
5.1 阴阳性对照
阳性对照：灭活禽流感病毒与新城疫病毒感染组织或鸡胚培养物。
阴性对照：正常鸡胚尿囊液或健康禽组织。
对照样品应-20℃保存。

5.2 样品采集与处理
5.2.1 采集工具
采集工具应经121℃±2℃高压灭菌20 min并烘干，包括棉拭子、剪刀、镊子、1.5 mL离心管及研钵。

5.2.2 棉拭子采集
将棉拭子插入咽喉或肛门旋转采样，放入含1.0 mL PBS的离心管中编号保存。

5.2.3 组织采集
剖检家禽，采集心、肝、脾、肺、肾、法氏囊等组织，置于无菌容器中编号保存。