DB33/T2268—2020
猫细小病毒PCR检测方法
PCR detection technique for feline panleukopenia virus

发布日期：2020-06-30
实施日期：2020-07-30

前言
本标准按照GB/T1.1—2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。主要起草人：张红丽、徐辉、赵灵燕、周彩琴、吴餐弦、黄靖、吕见涛、刘爱军、刘霞、吴雪军、孙冰冰、章杭建。

1 范围
本标准规定了猫细小病毒PCR（polymerase chain reaction）的实验条件、操作步骤、结果判定。本标准适用于猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒）的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 猫细小病毒 Feline panleukopenia virus (FPLV)：属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠炎病毒或猫瘟病毒。

4 实验条件
4.1 试剂
4.1.1 要求
除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。
4.1.2 试剂
4.1.2.1 核糖核酸酶（20mg/mL）
4.1.2.2 10%十二烷基磺酸钠溶液
4.1.2.3 10mg/mL蛋白酶K
4.1.2.4 Tris-盐酸饱和酚（pH 7.6）
4.1.2.5 酚-氯仿-异戊醇混合液（25:24:1）：在灭菌棕色瓶中按25:24:1比例分别加入酚、氯仿、异戊醇。
4.1.2.6 3mol/L乙酸钠（pH 5.4）
4.1.2.7 琼脂糖
4.1.2.8 10μg/μL溴化乙锭（ethidium bromide，EB）：溴化乙锭20mg、加灭菌双蒸水至20mL，充分溶解混匀而成。
4.1.2.9 50x TAE缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（Tris）24g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）100mL，加灭菌双蒸水至1000mL，充分混匀。
4.1.2.10 加样缓冲液：聚蔗糖25g、溴酚蓝0.1g、二甲苯青0.1g，加灭菌双蒸水至100mL，充分溶解混匀而成。
4.1.2.11 2.5mM dNTPs（deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸）
4.1.2.12 10x PCR Buffer
4.1.2.13 DNA分子量标准：DL2000
4.1.2.14 引物序列：FPLV-F: 5'-CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG-3'; FPLV-R: 5'-GGTGCATTTACATGAAGTCTTGG-3'

4.2 仪器设备
4.2.1 高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000xg以上。
4.2.2 PCR扩增仪
4.2.3 核酸电泳仪和水平电泳槽
4.2.4 微波炉
4.2.5 分析天平
4.2.6 恒温水浴锅
4.2.7 冷藏冰箱和低温冷冻冰箱
4.2.8 微量移液器
4.2.9 凝胶成像系统（或紫外透射仪）
4.2.10 高压灭菌锅
4.2.11 超净工作台或生物安全柜

5 操作步骤
5.1 样品的采集和处理
5.1.1 采集动物粪便、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理：
a) 肛拭子、粪便（加适量PBS）等样品经4℃、5000rpm/min离心2min，取上清液；
b) 全血样品待血凝后经5000rpm/min离心2min，取血清；
c) 取0.1g肠道等样品与灭菌PBS按1:5的重量体积比制成悬液，匀浆后，反复冻融3次，在涡旋混合器上混匀后经4℃、5000rpm/min离心10min，取上清液。
5.1.2 制备的样品在2℃～8℃保存时间不应超过24h，长期保存应分装成小管，置于-20℃以下，避免反复冻融。

5.2 DNA的提取
设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。
5.2.1 按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取：
a) 取1.5mL灭菌离心管，