ICS11.220 B41 DB32地方标准 DB32/T3683—2019 猪链球菌9型PCR检测技术规程 Technical regulation for PCR detecting Streptococcus suis Serotype 9 2019-12-04 发布 2019-12-25 实施 江苏省市场监督管理局 前言 本标准按照 GB/T1.1—2009 给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口，起草单位为江苏省农业科学院。主要起草人包括倪艳秀、何孔旺、周俊明、祝昊丹、吕立新、俞正玉、王丹丹、张雪寒、温立斌、李彬。 1 范围 本标准规定了猪链球菌9型 PCR 检测技术所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等要求。本标准适用于猪链球菌9型的 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 - GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 - NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 - 《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25号） 3 术语和定义 3.1 猪链球菌9型 (Streptococcus suis serotype 9) 属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1-31、33及1/2共33个血清型。猪链球菌9型是猪链球菌的一个血清型，对猪致病性强，并可感染特定人群，是一种人兽共患病病原菌。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 高速离心机、水浴锅、PCR 仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统。 4.2 主要试剂 生理盐水、超纯水、蛋白酶 K、2× PCR Mix、琼脂糖（电泳级）、DNA 分子量标准（DL2000 Marker）。 5 引物 5.1 上游引物：5'-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3' 5.2 下游引物：5'-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3' 6 方法步骤 6.1 样品处理 6.1.1 病料样品处理 采用差速离心法，取约5g病料（肝、肺或脑组织），剪碎研磨，用5 mL 生理盐水混悬，先 2000 r/min 离心 2 min，去除大组织块，取上清液后 10000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉淀以 200 μL 超纯水重悬备用。 6.1.2 待检培养物样品处理 取待检液体培养物（纯培养物或混合培养物）1 mL，10000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉淀以 200 μL 超纯水重悬备用。阴性对照为 THB 培养基，阳性对照为猪链球菌9型标准菌株（22083）的 THB 培养物。对照样品同样处理并编号标记。 6.2 DNA 提取 取 6.1 获得的样品及对照，每 200 μL 加入 3 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL），42℃ 作用 1 h，煮沸 5 min，10000 r/min 离心 5 min，上清液作为模板 DNA。 6.3 PCR 扩增 6.3.1 反应条件 25 μL 体系：2× PCR Mix 12.5 μL，上游引物（10 pmol/μL）1 μL，下游引物（10 pmol/μL）1 μL，模板 DNA 2 μL，超纯水 8.5 μL。PCR 条件：95℃ 5 min，循环 35 次：94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 30 sec，最后 72℃ 延伸 10 min，4℃ 保存。 6.3.2 电泳 将 PCR 反应产物于 1.2% 琼脂糖凝胶电泳，电压 120 V，时间 30 min。 6.3.3 结果观察 用凝胶成像系统观察结果并拍照。 7 结果判定 7.1 检测结果成立条件 阳性对照 PCR 产物电泳在 389 bp 位置出现特异性条带，阴性对照 PCR 产物无条带，则检测结果成立；否则不成立。 7.2 结果判定 7.2.1 若样品 PCR 产物在 389 bp 出现特异性条带，则判为阳性，即该样品为猪链球菌9型核酸阳性。 7.2.2 若样品 PCR 产物在 389 bp 未出现特异性条带，则判为阴性，即该样品为猪链球菌9型核酸阴性。 7.2.3 若阳性对照无目的条带或阴性对照出现目的条带，可能存在操作失误或污染，需要重复检测。 8 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物应进行无害化处理。检测过程中需采取措施防止交叉污染。