DB15/T 2033—2020
乳酸菌胞外多糖的分离纯化与鉴定技术规程
The technical specification for separation, purification and identification of lactic acid bacteria extracellular polysaccharides

前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。
本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。
本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、高民、修磊、盛守新、张昊池、潘娜、马燕芬、羿静。

1 范围
本文件规定了乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化与鉴定的方法与技术流程。本文件适用于乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化及鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 32198 红外光谱定量分析技术通则
GB/T 36240 离子色谱仪

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria (LAB)：一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、无芽孢、革兰氏染色细菌的总称。
3.3 乳酸菌胞外多糖 lactic acid bacteria exopolysaccharide (LABEPS)：乳酸菌在生长代谢过程中合成并分泌到胞外或渗入培养基中的多糖及其混合物。
硫酸-苯酚法 (sulfuric acid-phenol method)：利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖葡环，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。
3.4 离子交换层析 ion-exchange chromatography (IEC)：在一定 pH 条件下，根据被分离样品所带电荷不同而进行的分离方法。可根据样品性质来选择合适的离子交换介质。
3.5 凝胶层析 gel filtration chromatography：按照样品分子量大小进行分离的技术，又称凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。通常使用 Superdex、Superose、Sephacryl、Sepharose、Sephadex 等凝胶纯化介质。
3.6 紫外光谱 ultraviolet and visible spectrum (UV)：测定物质分子在紫外光区吸收光谱的分析方法。一般的紫外光谱是指近紫外区（200nm～380nm）的吸收光谱。
3.7 红外光谱 infrared spectroscopy (IR)：分子能选择性吸收某些波长的红外线，检测红外线被吸收的情况可得到物质的红外吸收光谱，又称分子振动光谱或振转光谱。通常所说的红外光谱即指中红外光谱（2.5μm～25μm）。
3.8 离子色谱 ion chromatography：高效液相色谱（HPLC）的一种，是利用被测物质的离子性分离和检测阴离子和阳离子的一种液态色谱方法。

4 材料、仪器和试剂
4.1 菌株材料
分离、保存并鉴定的乳酸菌菌株。
4.2 仪器
数显电热水浴锅、高蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超高速低温离心机、真空低温冷冻干燥机、荧光显微镜、倒置显微镜、高效液相色谱仪、核酸纯化系统、离子色谱仪、红外光谱仪、多角度激光检测器。
4.3 试剂与耗材
4.3.1 试剂
MRS 固体培养基、MRS 液体培养基、无水乙醇。
4.3.2 耗材
DEAE-Sepharose Fast Flow、Sepharose CL-6B、Column XK26/40、Column XK16/1、透析袋（截留量 8K～12K Da）。
4.3.3 多糖标准品
葡萄糖胺、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸。

5 测定步骤
5.1 乳酸菌粗多糖的提取
5.1.1 活化培养
用 MRS 固体培养基活化乳酸菌，挑取单菌落至 MRS 液体培养基中，厌氧条件下 37℃ 培养 20h。按 4% (v/v) 接种量接种到适量 MRS 液体培养基中，厌氧条件下 37℃ 培养 30h。将发酵后的菌液在 5000 rpm、4℃ 条件下离心 15min，弃去沉淀，收集上清。
5.1.2 三氯乙酸处理
上清液中缓慢加入浓度为 800 mg/mL 的三氯乙酸，使其终浓度为 40 mg/mL，4℃ 静置 8h 后，在 10000 rpm、4℃ 条件下离心 10min，弃去沉淀，收集上清。
5.1.3 无水乙醇处理
按 1:4 的体积比向上清液中加入无水乙醇，4℃ 过夜，10000 rpm、4℃ 条件下离心 10min 后收集底部沉淀。将沉淀溶于 60℃ 蒸馏水中，10000 rpm 离心 10min，弃去底部不溶沉淀，收集上清。
5.1.4 透析
将上清液装入截留分子量为 8K Da 的透析袋内，透析 2h～4h 后，更换透析液，之后每 6h～8h 更换一次透析液，连续透析 2d。收集透析袋内多糖溶液，真空冷冻干燥制得乳酸菌粗多糖。
5.2 粗多糖纯化
5.2.1 离子交换纯化
5.2.1.1 层析柱处理
将 DEAE-Sepharose Fast Flow 填料装填于 Column XK26/40（内径：26mm，高度 400mm）层析柱中，体积为 150mL，用 Tris-HCl 溶液（50 mM, pH 7.5～7.8）以 1.5 mL/min 流速过夜平衡层析柱。
5.2.1.2 纯化
将粗多糖溶于 Tris-HCl 中，配成浓度为 10 mg/mL 的溶液，0.22μm 滤膜过滤后上样。流动相使用 Tris-HCl 和含 1 M NaCl 的 Tris-HCl 洗脱液，将蛋白质核酸纯化系统的流速设置为 2.0 mL/min，每 3min 收集一次洗脱液至试管中。
5.2.1.3 洗脱曲线绘制
用硫酸-苯酚法测定洗脱液中多糖含量，在 490nm 处检测吸光值，绘制洗脱曲线。
5.2.2 分子筛纯化
5.2.2.1 层析柱处理