ICS 65.020.01
CCS B05

DB23
黑龙江省地方标准
DB23/T 3897—2024

基于CoY辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程

2024-12-30 发布
黑龙江省市场监督管理局
2024-12-30 实施

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省农业农村厅提出。本文件起草单位：东北农业大学、黑龙江省绿色食品科学研究院、哈尔滨学院、黑龙江省农业科学院。
本文件主要起草人：胡小梅、李凤兰、董士嘉、李孝忠、王浩、谷春涛、高爱丽、孙以新、冯旭、高云飞、虞琦、贺付蒙、田苗。

基于CoY辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程

1 范围
本标准界定了基于CoY辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术的术语和定义，规定了秸秆降解真菌创制、突变菌株筛选鉴定、秸秆降解菌株保藏和档案管理。本文件适用于CoY辐射诱变创制秸秆降解真菌种质资源的筛选与鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 10252 Y辐照装置的辐射防护与安全规范
GB/T 17568 辐照装置设计建造和使用规范
GB/T 23874 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法
HJ 710.11—2014 生物多样性观测技术导则 大型真菌
NY/T 3494 农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定
SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

3.1 秸秆降解真菌
能够将作物秸秆分解、腐化的一类产孢丝状真菌。

4 秸秆降解真菌创制

4.1 菌种来源
从自然环境中分离的具有降解秸秆能力的真菌。

4.2 培养方法

4.2.1 培养基

4.2.1.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
马铃薯浸出粉12 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，去离子水定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min。

4.2.1.2 高粱粒培养基
高粱粒5 g，去离子水5 mL，121 ℃灭菌20 min。

4.2.1.3 产酶培养基（MA）
十二水磷酸氢二钠17.907 g，硫酸铵1.4 g，磷酸二氢钾2.0 g，七水硫酸镁0.60 g，氯化钙0.60 g，尿素0.3 g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.5 mL，蛋白胨2.0 g，微量元素溶液1 mL，pH 5.5，去离子水定容至1000 mL。

4.2.1.4 微量元素溶液
七水硫酸亚铁0.5 g，一水硫酸锰0.16 g，七水硫酸锌0.14 g，六水合二氯化钴0.2 g，去离子水定容至100 mL，0.22 μm无菌滤膜过滤除菌。

4.2.2 菌种活化
将冻存的菌种解冻后在PDA培养基上采用四区划线方法进行活化，长出单菌落后，备用。

4.2.3 孢子悬浮液制备
将菌种活化后长出的单菌落接种至高粱粒培养基中，30 ℃培养，菌丝长满平板48 h后，将产生的孢子用无菌0.9%（w/v）生理盐水洗脱并用四层无菌纱布过滤除去菌丝体，在6000 rpm条件下离心20 min收集沉淀。将沉淀再用适量生理盐水重悬后，利用血球计数板计算孢子浓度，并用生理盐水将孢子浓度稀释至1×10^6 CFU/mL~1×10^8 CFU/mL。

4.3 辐射处理

4.3.1 辐射剂量
选择金属元素钴源（Co-60）的γ射线进行辐射诱变处理，真菌孢子悬浮液的CoY辐射剂量以2000 Gy为宜。

4.3.2 辐射装置
Co辐射装置应符合GB/T 17568的规定。

4.3.3 辐射方法
将孢子悬浮液均匀铺在铝箔盘或培养皿中，置于辐射装置中心，按照设定剂量进行辐照，辐照结束后立即取出避光保存。

5 突变菌株筛选鉴定

5.1 菌株筛选

5.1.1 筛选指标
筛选指标包括菌株致死率、形态指标、纤维素酶和半纤维素酶活力、木质素酶活力和秸秆降解率。

5.1.2 致死率
诱变结果以致死率表示，致死率按式（1）计算：
LR = (Cc - Ct) / Cc × 100% (1)
式中：
LR——致死率；
Cc——阴性对照PDA平板菌落数；
Ct——试验组PDA平板菌落数。

5.1.3 形态指标筛选
将辐射诱变后符合致死率≥85%的菌株孢子悬浮液稀释100倍，取100 μL稀释孢子液涂布在PDA平板上。在28 ℃下培养至长出菌落，进行形态学观察，并与诱变前的菌株进行比较，获得形态上具有差异的突变菌株。

5.1.4 纤维素酶和半纤维素酶活力测定

5.1.4.1 内切葡聚糖酶活力
取1%（w/v）羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液1.5 mL，加入0.5 mL稀释后的粗酶液，50 ℃水浴条件下孵育30 min。采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）测定法，加入1.5 mL DNS显色剂。沸水浴5 min终止反应，在540 nm波长处测定吸光度，三次重复实验。根据葡萄糖标准曲线计算酶活力，每分钟水解CMC-Na产生1 μmol还原糖所需的酶量定义为1 U。对照组中加入沸水浴30 min灭活的粗酶液，其它条件均相同，按照式（2）计算酶活力。

5.1.4.2 外切葡聚糖酶活力
取0.1%（w/v）对硝基苯酚纤维二糖苷（pNPC）溶液50 μL，加入100 μL稀释后的粗酶液，50 ℃水浴条件下孵育30 min。加入150 μL 10% Na2CO3溶液终止反应，在420 nm波长下测定吸光度，三次重复实验。根据对硝基苯酚标准曲线计算酶活力，每分钟水解pNPC产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1 U。对照组中加入沸水浴30 min灭活的粗酶液，其它条件均相同，按照式（2）计算酶活力。

5.1.4.3 β-葡萄糖苷酶活力
取0.5%（w/v）水杨苷溶液加入0.5 mL稀释后的粗酶液，在50 ℃水浴条件下孵育30 min。采用DNS测定法，加入1.5 mL DNS显色剂，沸水浴5 min终止反应，在540 nm波长处测定吸光度，三次重复实验，根据葡萄糖标准曲线计算酶活力，每分钟水解水杨苷产生1 μmol还原糖所需的酶量定义为1 U。对照组中加入沸水浴30 min灭活的粗酶液，其它条件均相同，按照式（2）计算酶活力。

5.1.4.4 木聚糖酶活力
按照GB/T 23874的规定执行。

式（2）：
U = (m × n × 1000) / (M × t) (2)
式中：
U——相应纤维素或半纤维素酶活力；
m——根据标准曲线方程计算出相应葡萄糖或对硝基苯酚质量（mg）；
M——葡萄糖或对硝基苯酚摩尔质量（g/mol）；
t——酶解反应时间（min）；
1000——转化因子，1 mmol=1000 μmol。