ICS 11.220 B41 DB21/T2469—2015 H1N1亚型猪流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Method of fluorescent RT-PCR for the detection of H1N1 swine influenza virus 2015-04-30发布 2015-06-30实施 发布单位：辽宁省质量技术监督局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，由辽宁省畜牧兽医局归口管理。本标准起草单位为辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。主要起草人：关淼、曹东、兰德松、魏某、赵凤菊、陈瑶、姚伟、刘坤洋、张雷、杨国丽、魏园园。 1 范围 本标准规定了H1N1亚型猪流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）荧光RT-PCR检测方法的范围、器材和试剂、引物和探针、操作步骤、结果判定及废弃物处理等内容。 本标准适用于H1N1亚型猪流感的诊断、监测以及流行病学调查，适用于猪鼻咽拭子、肺脏及肺门淋巴结、鸡胚尿囊液及细胞培养物中H1N1亚型SIV的HA和NA基因检测。 本标准规定的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）及以上实验室中进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 《兽医实验室生物安全技术管理规范》 《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》 GB/T 27521-2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 GB/T 27536-2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 3 缩略语 本标准采用下列缩略语： SIV：猪流感病毒（swine influenza virus） 荧光RT-PCR：荧光反转录聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary DNA） HA：血凝素（hemagglutinin） NA：神经氨酸酶（neuraminidase） PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate） 4 原理 猪流感病毒（SIV）为RNA病毒，其RNA经反转录生成cDNA后，可作为PCR扩增模板。根据H1N1亚型SIV的保守基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，在DNA聚合酶作用下进行扩增。 TaqMan探针为一段寡核苷酸，其两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团。在PCR扩增过程中，探针被酶切降解，使报告基团与淬灭基团分离，从而产生可被仪器检测的荧光信号。 5 器材和试剂 5.1 器材 包括高速冷冻离心机（≥12000 r/min）、冰箱（2～8℃、-20℃、-70℃）、混合器、荧光PCR扩增仪、微量移液器、病毒采集管、PCR八联管或96孔板、各规格吸头（10μL、200μL、1000μL）、无菌注射器、离心管（1.5mL、15mL）。 相关器具需经灭菌处理：离心管121℃高压灭菌15min；研钵、剪刀、镊子等器具160℃干热灭菌2h。 5.2 试剂 PBS缓冲液：经121℃高压灭菌后，在无菌条件下加入青霉素和链霉素。 Trizol试剂：RNA提取试剂，4～8℃保存。 氯仿、异丙醇：使用前预冷至4℃。 75%乙醇：由无水乙醇与DEPC水配制，-20℃保存。 DEPC水：按0.1%比例配制，经37℃处理1h后高压灭菌，避光密闭保存。 RNA酶抑制剂（40U/μL）。 DNA聚合酶（如Ex Taq HS，5U/μL）。 6 引物和探针 用于RT-PCR反应的引物浓度为20μmol/L。H1亚型HA基因引物及探针序列如下： 上游引物F1：5'-CCTCTACCAGAATAATCATAC-3' 下游引物R1：5'-CAGTGTCCAGTAATAATTCA-3' 探针P1：5'-(FAM)TCTGCCTGCTTGTTCTCTGA-3'