ICS65.020.30 B43 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB65/T3501—2013 绵羊卵母细胞体外受精技术操作规程Operational regulation for IVF technique of Ovine oocytes地方标准信息服务平台 2013-08-10发布 新疆维吾尔自治区质量技术监督局2013-09-10实施 发布 前言 DB65/T3501--2013 本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》要求编写。本标准由新疆维吾尔自洽区畜收厅提出。本标准由新弱维吾尔自治区畜牧厅归厂。本标准由新疆畜牧科学院畜收科学研究所负责起草。本标雅士要起草人：田可川、吴伟伟、哈尼克孜、口月珍、徐新明、张绝花、狄江、泊冈、于丽婿、付雪峰、玛尔孜亚、阿礼提、拉扎提、黄文莱、阿米娜、马依拉·吐尔逊、艾头提·买买提、詹振宏、刘券箔地方标准信息服务平台 1范围 绵羊卵母细胞体外受精技术操作规程DB65/T3501-2013 本规程规定了绵羊卵母组胞体外受精的术谱写定义、要求、卵母细胞收集、体外受精、胚胎的体外培养和胚胎发育。 本规程适用于规范绵羊卵母细胞体外受精技术。2规范性文件引用 下列文件对于本表准的应用是必不可少的。凡足注明日期的引文件，仅注期的版本适用丁本标准。凡是不注石期的引用义作，其最新版本（包活所有的修改单）适用于本标准。中华人民共和国药典 3术语与定义 下列术语与定义适用十本标准 3.1检卵OvumSearching 检卵是从回收液中，用放大（10~15）倍的实体显微镜，将卵母组跑检出，移全新鲜的增养液巾，再移入成熟液培养。 3.2体外受精lnvitrofertilization，IVF体外受精是指在体外环境完成的精卵结合的过程。体外受精技术包括卵母纽胞的体外成熟、精子的体外狭获能、卵母细驱的体外受精、以及受精卵的体外发育剂胫脸保存等。4要求 4.！试剂和溶液 4.1.1所用的试剂除特殊概定外，均为分新纯以上的化学试剂：用于配制各种溶液的水为电阻值超过18M2的超纯水；配好溶液PH值为7.2~7.6，渗透压为270mOsm/kg~290mOsm/kg，低温4℃~5保存。 4.1.2培养液中使的血清，小血清白蛋白（BSA）和抗生素应符合组织培养要求。胎牛血清/证清使用前需经过质罩检测，无菌、无支体、无病毒和内毒素：肉眼观察淡黄色，澄清透明，教少溶血，无杂质。血清中的补体对还胎有毒证作用，使用前需置于56℃的水浴锅中孵食30min，经灭活处理店的血消可分装，在低温4℃或-20℃冷冻保荐用前醒冻后过滤。由于动物个体间的兼异，血清在使用前应作促卵生长效应的测定。 4.1.3配制好的无机化学溶液应采用高压灭菌法消丧。消、抗生素等在高温条停下易变性应使用过服务平 滤消醇（滤膜孔当0,45um），然后添加到溶液中。4.1.4药品应符合宁华人民共和国药典的规定。4.1.5肝胎生产的药品见附录A。4.2设备和器械与环境 4.2.1器械：使用无菌的一次性塑料培养Ⅲ、容器、注射器、针头利吸液管，用后手，不要亘复使用，所有可重复使用的器血、不锈钢器械、过滤器，冲卵管以及其它用品用后应立即洗涤下净、干燥，使用前必须用适宜的方法消带灭菌。4.2.2设备：所有设备的外表，特别见空调和冰箱通风口每周应消洗一次.小型设备（如显微镜、拉针仪、显微操作仪等）要用塑料罩上，实体显微镜的载物台使用对至少应每天用70%酒精擦拭消率次。培养DB65/T3501-2013 箱应放垒在实验空空气流动小、人员少去的部位。对培养箱的温度、湿度和C02水平应每周进行监控和调节，通常每半年消毒一次。 4.2.3实验宰：胚始/卵母细胞专用。应光线充定、清消无尘，备有应急照明灯，实验室顶柳和墙壁的材料应无孔隙，其表面必须密封。通风系统采用高效微粒过滤，通风装置至少每固消避一次，非工作人员限制入内，具体方法见附录C（规范性附录）。4.2.4实验索、采卵室等场所应保持整洁，使用前必须消毒。5卵母细胞收集 5.1收集卵巢 在居宰后的绵单重找到卵巢，将卵巢剪下来放到保温瓶的A液里，A液维持在（30~37)℃之问，但温保存，收集时间不能超过1.5h，收集严送间实验室进行体外成熟。5.2抽卵 将针头从透明的卵泡边缘捕入，不宜太深，抽边轻死，吸山卵母细跑，每吸3-5枚后，吸少量拍卵液，以防卵母细施粘附在针管壁上，再将抽取的卵母红胞混合液注入有2m抽卵液的试管中，恒温保存，用2、3个注射器交换抽卵；抽完一侧卵巢再抽另例卵巢的卵母细孢，抽完后同实验室掠卵。5.3栋鄄 从培养箱中取出90mm培养Ⅲ和二个加抽卵液的小，将加拖卵液的小血先放入性温板上充有3%cO，气体的黑愈了中。再用1ml移液枪将带有卵母细胞的回收液移入90mm培养血中（转移时从管底吸取液体），进行镜检迅速将炼函的卵母细跑移入1号皿巾，将1号且放入黑盒子中，然后复检90mm且，确认卵母细胞已全部栋出，再继续将剩余的国改液进行卵。5.4洗卵 将1号血中的卵母细胞反复吹吸（3~5）次，然后移入2号肌中冲洗，最后将所有的卵母细胞集中到3号血，放回培养箱。 5.5入孵 从培养箱中取出二个成熟液洗血和成熟Ⅲ放入恒温板的黑盒子里，将3盘卵母细胞移入盛有成熟液的4盘和5盘中，冲洗两次，然后将冲洗好的卵母纸胞分级（详见附表4），移入到成熟血中，每个孔中30枚卵母胞，在成熟Ⅲ盖上标出供体羊号码和每孔中卵母细胞数默。然后放入培养箱中进行成熟塔养“[培养条件：502、38.6℃、(22-~24)h)\.6体外受精（IVF） 6.1精液的采集、稀释与获能 6.1.1准备工作 6.1.1.1消藓：将集精杯；带刻度的玻璃试育，200mi施杯，高温高压消毒。6.1.1.2打升恒温水浴锅，将温度调在(36~37)℃。口6.1.1.3将带刻度的被响试管和载玻片放在恒温板上预热，6.1.1.4将精液稀释液移入14hml带盖的试管中，放在水锅内的架中：预热6.1.2菜精 6.1.2.1很据供体羔羊育种计划要改利采集卵母细胞休外受精的需要，确定所采种公单的数量：6.1.2.2根据绵羊人下授精操作规程要求采精。6.1.2.3选用符合要求已生产的冷冻精液。6.1.3精液的稀释 6.1.3.1根据绵单人工授精操作规程要求检查精子活力、密度。6.1.3.2配制牛奶卵黄稀释液，并在恒温水浴锅力预热。6.1.3.3精液品质较好的可以稀释(5～6)倍，如精液品质稍差，可以降低稀释的俯数。2 DB65/T3501-2013 6.1.3.4精液稀释是在水浴锅巾中进行，用移液枪轻轻将精液移入预热好玻璃试管中，并读取刻度，确定加入精液稀释液的量，移液枪吸取已顶热稀释液，轻轻打入玻璃管底部（切忌用力过猛利一次全部将稀释液打入），然后从液面吸攻部分，再将移液枪伸入管底，打出部分，这样反复吸打混匀。然店再吸取部分稀释液，操作同上，直到达到所要稀释的刻度。6.1.3.5用铅箔纸包好精液管，标山种羊的号码和日期；放入200ml水浴锅温水烧杯中，置丁4\℃的冰箱中过夜获能备片。 6.2体外受精的准备 6.2.1在体外受精前一大，配制体外受精液，放入冰箱冷凝中。6.2.2受精前（2~3）h，衡受精液。培养Ⅲ益上标出，IVF和日期：将受精液点入培养Ⅲ中，年个增养血7个滴，每滴加50ul受精液，覆盖3ml石蜡注，放入培养箱巾平衡。6.2.3洗血用记号笔标上1、2和3，每匝加入2ml的受精液；同附准备-个空Ⅲ，放入培养箱乎衡。6.2.4精液上浮管按照每2个培养滴个试管，每管移入0.5ml的受精液，放入培养箱中平衡。6.2.5用75%的酒精喷体视镜上的恒温板与体视镜周的台面上，然后用已消需过的纸巾擦干。6.2.6在酒精灯上拉直径小丁250um的吸管，并在体视镜下检查管口是否平整，放好备用：用于吹打掉卵母细胞周围已扩散的部分颗粒细胞层。6.3精液上浮 6.3.1准备工作 6.3.1.1植温水浴锅准备，检查恒温水浴锅中水量，打开，定温到（36~37）℃。6.3.1.2将8ml玻腐试管和载玻片放在恒温板上预热。6.3.2精液上浮 6.3.2.1在体外受精前30min，将8ml玻璃试管置于水浴锅内.6.3.2.2从4℃冰箱取出液（带烧杯一起取出），用移液枪从中移出300ul，慢慢放入水浴锅内的试管底部，轻轻播动试管，均勾受热(30-40)s后。6.3.2.3检查精液的品质，如精液品质衰好，用移液枪移取50ml，轻轻打入培养箱内精液上浮管中（移液枪头放至管底，每管50l)，放入培养箱中，上浮时问最少20mil，切忌振荡上浮管。6.4体外受精（IVF） 6.4.1根据入孵的时间衣次进行体外受精。6.4.2将3个受液洗卫和受情盘取出，放入加热台的黑盒子里；将受精液液体倒入空血（H且）。6.4.3从培养箱中取出成熟盘，放在体视镜下观察卵母细胞的成熟情况，成熟后的卵母细胞颖粒细胞发生扩散。 6.4.4用吸管将四孔盘中成熟的卵丹细胞移入1盘中，对卵母细胞稍微吹打，迅速移入1号受精液洗血中，将】号受精液洗血放回黑盒子，检查四九盘中是可还有米吸出的卵母细胞；然后将1号受精液洗血中的卵母细胞移入2号受精液洗Ⅲ，再移入3号受精液，最后移入受精培养皿中，放回培养箱。6.4.5用移液枪从精液上浮管的最上层移取(50～80)叫上浮精液世约2×10°个，最终密度每m！为2X10°个]，轻轻打入受精滴中，标住每孔的卵母细胞数量、公举，放入喷养箱[培养条件：5%CO2、38.6℃，（26-30)h）。记录IVF时问，填写附表46.4.6体外受精时，每滴最多放入30枚卵母细胞。7胚胎的体外培养（IVC） 7.1准备工作 7.1.1将培养液放入增养箱中，松开瓶盖，平衡2~-3h。7.1.2胚胎培养液洗血的准备，每血2ml培养液，放入培养箱中平衡。7.1.3将培养液移入四孔盘中，每孔500μl，加盖300ul矿物油，标出IVC和日期，放入培养箱中平3