ICS 65.020.30
B 43
DB65
新疆维吾尔自治区地方标准
DB65/T 3501—2013
绵羊卵母细胞体外受精技术操作规程
Operational regulation for IVF technique of Ovine oocytes

2013-08-10 发布
2013-09-10 实施

前言

本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规定起草。
本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅提出。
本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。
本标准由新疆畜牧科学院畜牧科学研究所负责起草。
本标准主要起草人：田可川、吴伟伟、哈尼克孜、古月珍、徐新明、张红花、狄江、泊冈、于丽娟、付雪峰、玛尔孜亚、阿礼提、拉扎提、黄文莱、阿米娜、马依拉·吐尔逊、艾头提·买买提、詹振宏、刘券箔。

1 范围

本规程规定了绵羊卵母细胞体外受精的术语和定义、要求、卵母细胞收集、体外受精、胚胎的体外培养和胚胎发育。
本规程适用于规范绵羊卵母细胞体外受精技术。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
中华人民共和国药典

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1
检卵 Ovum Searching
从回收液中，用放大（10~15）倍的实体显微镜，将卵母细胞检出，移入新鲜的培养液中，再移入成熟液培养。

3.2
体外受精 in vitro fertilization，IVF
在体外环境完成的精卵结合的过程。体外受精技术包括卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、卵母细胞的体外受精、以及受精卵的体外发育及胚胎保存等。

4 要求

4.1 试剂和溶液
4.1.1 所用的试剂除特殊规定外，均为分析纯以上的化学试剂；用于配制各种溶液的水为电阻值超过18 MΩ的超纯水；配好溶液pH值为7.2~7.6，渗透压为270 mOsm/kg~290 mOsm/kg，低温4℃~5℃保存。
4.1.2 培养液中使用的血清、牛血清白蛋白（BSA）和抗生素应符合组织培养要求。胎牛血清/血清使用前需经过质量检测，无菌、无支原体、无病毒和内毒素；肉眼观察淡黄色，澄清透明，极少溶血，无杂质。血清中的补体对胚胎有毒害作用，使用前需置于56℃的水浴锅中孵育30 min，经灭活处理后的血清可分装，在低温4℃或-20℃冷冻保存，使用前解冻后过滤。由于动物个体间的差异，血清在使用前应作促卵生长效应的测定。
4.1.3 配制好的无机化学溶液应采用高压灭菌法消毒。激素、抗生素等在高温条件下易变性，应使用过滤除菌（滤膜孔径0.45 μm），然后添加到溶液中。
4.1.4 药品应符合中华人民共和国药典的规定。
4.1.5 胚胎生产的药品见附录A。

4.2 设备和器械与环境
4.2.1 器械：使用无菌的一次性塑料培养皿、容器、注射器、针头和吸液管，用后即弃，不要重复使用。所有可重复使用的器皿、不锈钢器械、过滤器、冲卵管以及其他用品用后应立即洗涤干净、干燥，使用前必须用适宜的方法消毒灭菌。
4.2.2 设备：所有设备的外表，特别是空调和冰箱通风口每周应清洗一次。小型设备（如显微镜、拉针仪、显微操作仪等）要用塑料罩盖上。实体显微镜的载物台使用时至少应每天用70%酒精擦拭消毒一次。培养箱应放置在实验室空气流动小、人员少去的部位。对培养箱的温度、湿度和CO2水平应每周进行监控和调节，通常每半年消毒一次。
4.2.3 实验室：胚胎/卵母细胞专用。应光线充足、清洁无尘，备有应急照明灯。实验室顶棚和墙壁的材料应无孔隙，其表面必须密封。通风系统采用高效微粒过滤，通风装置至少每周消毒一次，非工作人员限制入内，具体方法见附录C（规范性附录）。
4.2.4 实验室、采卵室等场所应保持整洁，使用前必须消毒。

5 卵母细胞收集

5.1 收集卵巢
在屠宰后的绵羊中找到卵巢，将卵巢剪下来放到保温瓶的A液里，A液维持在（30~37）℃之间，恒温保存，收集时间不能超过1.5 h，收集后尽快送实验室进行体外成熟。

5.2 抽卵
将针头从透明的卵泡边缘刺入，不宜太深，抽动轻微，吸出卵母细胞。每吸3~5枚后，吸少量冲卵液，以防卵母细胞粘附在针管壁上。再将抽取的卵母细胞混合液注入有2 ml冲卵液的试管中，恒温保存。用2、3个注射器交换抽卵；抽完一侧卵巢再抽另一侧卵巢的卵母细胞，抽完后同实验室送卵。

5.3 检卵
从培养箱中取出90 mm培养皿和二个加冲卵液的小皿，将加冲卵液的小皿先放入恒温板上充有3% CO2气体的黑盒子中。再用1 ml移液枪将带有卵母细胞的回收液移入90 mm培养皿中（转移时从管底吸取液体），进行镜检，迅速将健康的卵母细胞移入1号皿中，将1号皿放入黑盒子中，然后复检90 mm皿，确认卵母细胞已全部检出，再继续将剩余的回收液进行检卵。

5.4 洗卵
将1号皿中的卵母细胞反复吹吸（3~5）次，然后移入2号皿中冲洗，最后将所有的卵母细胞集中到3号皿，放回培养箱。

5.5 入孵
从培养箱中取出二个成熟液洗皿和成熟皿放入恒温板的黑盒子里，将3号皿卵母细胞移入盛有成熟液的4号皿和5号皿中，冲洗两次，然后将冲洗好的卵母细胞分级（详见附表4），移入到成熟皿中，每个孔中30枚卵母细胞。在成熟皿盖上标出供体羊号码和每孔中卵母细胞数目。然后放入培养箱中进行成熟培养（培养条件：5% CO2、38.6℃、(22~24) h）。

6 体外受精（IVF）

6.1 精液的采集、稀释与获能
6.1.1 准备工作
6.1.1.1 消毒：将集精杯、带刻度的玻璃试管、200 ml烧杯进行高温高压消毒。
6.1.1.2 打开恒温水浴锅，将温度调在(36~37)℃。
6.1.1.3 将带刻度的玻璃试管和载玻片放在恒温板上预热。
6.1.1.4 将精液稀释液移入14 ml带盖的试管中，放在水浴锅内的架中预热。

6.1.2 采精
6.1.2.1 根据供体羔羊育种计划要求和采集卵母细胞体外受精的需要，确定所采种公羊的数量。
6.1.2.2 根据绵羊人工授精操作规程要求采精。
6.1.2.3 选用符合要求已生产的冷冻精液。

6.1.3 精液的稀释
6.1.3.1 根据绵羊人工授精操作规程要求检查精子活力、密度。
6.1.3.2 配制牛奶卵黄稀释液，并在恒温水浴锅中预热。
6.1.3.3 精液品质较好的可以稀释(5~6)倍，如精液品质稍差，可以降低稀释的倍数。
6.1.3.4 精液稀释是在水浴锅中进行，用移液枪轻轻将精液移入预热好玻璃试管中，并读取刻度，确定加入精液稀释液的量。移液枪吸取已预热稀释液，轻轻打入玻璃管底部（切忌用力过猛和一次全部将稀释液打入），然后从液面吸取部分，再将移液枪伸入管底，打出部分，这样反复吸打混匀。然后再吸取部分稀释液，操作同上，直到达到所要稀释的刻度。
6.1.3.5 用铝箔纸包好精液管，标出种羊的号码和日期；放入200 ml水浴锅温水烧杯中，置于4℃的冰箱中过夜获能备用。

6.2 体外受精的准备
6.2.1 在体外受精前一天，配制体外受精液，放入冰箱冷凝中。
6.2.2 受精前（2~3）h，平衡受精液。培养皿盖上标出IVF和日期；将受精液点入培养皿中，每个培养皿7个滴，每滴加50 μl受精液，覆盖3 ml石蜡油，放入培养箱中平衡。
6.2.3 洗皿用记号笔标上1、2和3，每皿加入2 ml的受精液；同时准备一个空皿，放入培养箱平衡。
6.2.4 精液上浮管按照每2个培养滴一个试管，每管移入0.5 ml的受精液，放入培养箱中平衡。
6.2.5 用75%的酒精喷洒体视镜上的恒温板与体视镜周的台面上，然后用已消毒过的纸巾擦干。
6.2.6 在酒精灯上拉直径小于250 μm的吸管，并在体视镜下检查管口是否平整，放好备用，用于吹打掉卵母细胞周围已扩散的部分颗粒细胞层。

6.3 精液上浮
6.3.1 准备工作
6.3.1.1 准备温水浴锅，检查恒温水浴锅中水量，打开，定温到（36~37）℃。
6.3.1.2 将8 ml玻璃试管和载玻片放在恒温板上预热。

6.3.2 精液上浮
6.3.2.1 在体外受精前30 min，将8 ml玻璃试管置于水浴锅内。
6.3.2.2 从4℃冰箱取出精液（带烧杯一起取出），用移液枪从中移出300 μl，慢慢放入水浴锅内的试管底部，轻轻摇动试管，均匀受热(30~40) s后。
6.3.2.3 检查精液的品质，如精液品质良好，用移液枪移取50 μl，轻轻打入培养箱内精液上浮管中（移液枪头放至管底，每管50 μl），放入培养箱中，上浮时间最少20 min，切忌振荡上浮管。

6.4 体外受精（IVF）
6.4.1 根据入孵的时间依次进行体外受精。
6.4.2 将3个受精液洗皿和受精盘取出，放入加热台的黑盒子里；将受精液液体倒入空皿（H皿）。
6.4.3 从培养箱中取出成熟盘，放在体视镜下观察卵母细胞的成熟情况，成熟后的卵母细胞颗粒细胞发生扩散。
6.4.4 用吸管将四孔盘中成熟的卵母细胞移入1号皿中，对卵母细胞稍微吹打，迅速移入1号受精液洗皿中，将1号受精液洗皿放回黑盒子，检查四孔盘中是否还有未吸出的卵母细胞；然后将1号受精液洗皿中的卵母细胞移入2号受精液洗皿，再移入3号受精液，最后移入受精培养皿中，放回培养箱。
6.4.5 用移液枪从精液上浮管的最上层移取(50~80) μl上浮精液（约2×10^6个，最终密度每ml为2×10^6个），轻轻打入受精滴中，标出每孔的卵母细胞数量、公羊，放入培养箱（培养条件：5% CO2、38.6℃，(26~30) h）。记录IVF时间，填写附表4。