DB37/T4053—2020 新城疫病毒基因VI型荧光定量PCR检测方法

前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院禽研究所。
本标准主要起草人：孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、元丽红。

1 范围
本标准规定了新城疫病毒基因VI型（NDV）荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VI型的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 试验原理
实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBR Green I荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

4 试剂或材料
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。
4.1 10×磷酸盐缓冲液：pH值7.2
4.2 研钵
4.3 病毒RNA提取试剂盒
4.4 SYBR Green I RT-PCR缓冲液
4.5 酶混合物：内含MLV反转录酶和RNase inhibitor
4.6 DNA聚合酶
4.7 阳性对照：浓度为1.0×10^6拷贝/μL的阳性质粒
4.8 阴性对照：水、DEPC水

5 仪器设备
5.1 微量可调移液器：最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL。
5.2 台式高速冷冻离心机：最高转速16000r/min。
5.3 荧光定量PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃。
5.4 分析天平：精度为0.01g