DB13/T5688—2023
蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术规程

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：石家庄赞皇县蕊源蜂业有限公司、中国农业科学院蜜蜂研究所、石家庄市动物疫病预防控制中心。
本文件主要起草人：王强、王荣申、王岳森、魏月、王岳峰、孟君丽、许亚改、王占江、陈海军、郭伟婷、张艳红、杜义明、刘旭东、孙继强、姚慧敏、谢峰、马丽荣、路伟、张晨、贾二国、王聪敏。

1 范围
本文件规定了蜜蜂微孢子虫病绿色防治的术语和定义、技术流程图、诊断与鉴定、防控等技术要求。本文件适用于蜜蜂微孢子虫病症状、形态及分子生物学诊断和综合防治。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件：
GB/T 19168 蜜蜂病虫害综合防治规范
SN/T 1683 蜜蜂微孢子虫病诊断方法
OIE 陆生动物卫生法典

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 蜜蜂微孢子虫：是一种侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞引起蜜蜂发病的致病性真菌，包括蜜蜂微孢子虫和东方蜜蜂微孢子虫2个种。
3.2 消毒：指为杀灭包括蜜蜂疫病病原体或寄生虫而采取的一种措施，适用于可能被直接或间接污染的场所、工具及各种物体。[来源：OIE陆生动物卫生法典，有修改]。
3.3 监测：指系统而持续地收集、整理和分析与蜜蜂微孢子虫病有关的信息，并及时向相关人士传递信息以便采取相应的措施。

蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术流程图
开始 $\rightarrow$ 取样 $\rightarrow$ 诊断与鉴定 (5.1 诊断流程 $\rightarrow$ 5.2 症状 $\rightarrow$ 5.3 实验室鉴定) $\rightarrow$ 防控 (6.1 养蜂场场址选 $\rightarrow$ 6.2 饲养管理 $\rightarrow$ 6.3 监测 $\rightarrow$ 6.4 防治) $\rightarrow$ 结束

5 诊断与鉴定
5.1 诊断流程
当观察到蜂群出现典型症状时，应遵循先通过个体症状观察初步确诊，再取样后通过显微镜鉴定即可确诊。如需对没有明显症状的蜂群进行早期诊断或例行养蜂场的病害监控，则可采用PCR鉴定方法。

5.2 症状
5.2.1 蜂群症状
a) 急性重症感染：当蜂群感染处于后期重症阶段时，蜂群粪便（蜂箱外壁或周围地面）会出现大量棕色约0.5cm长的细长条状粪便，或出现粪便变稀、颜色变深现象；蜂群表现为在蜂巢入口处及养蜂场地面，会见到患病爬行的和死去的蜜蜂，且蜂群群势急速下降。
b) 轻度感染：除了部分成年蜜蜂在蜂箱外爬行外，没有其他异常表现。

5.2.2 蜜蜂个体症状
蜜蜂个体感染病原后可通过如下症状进行初步判断：
a) 病蜂活动状况：患病蜜蜂表现出行动迟滞，腹部膨大，飞翔无力等症状。
b) 内部解剖观察：用镊子从具有典型症状的蜜蜂腹部末端夹出中肠及后肠仔细观察。健康蜜蜂中肠呈棕色，环纹明显，并且具有弹性和光泽。如观察到蜜蜂中肠膨大，呈乳白色，环纹不清，失去弹性和光泽，可初步确定为蜜蜂微孢子虫病。

5.3 实验室鉴定
5.3.1 显微镜鉴定
5.3.1.1 样品处理：将采集的蜜蜂样本，分离腹部置于研钵中，加入5mL～10mL蒸馏水研磨。取研磨的组织涂片，在明场或相差光学显微镜下以400～600倍进行检查。
5.3.1.2 鉴定
5.3.1.2.1 初诊：如在视野中见到长约5μm～7μm，宽约3μm～4μm，椭圆形的孢子，边界折光明显，则可初步确诊。
5.3.1.2.2 鉴别：按SN/T 1683相关方法与酵母、真菌孢子、脂肪体或马氏管变形虫囊包进行鉴别。

5.3.2 PCR鉴定
5.3.2.1 DNA提取
提取缓冲液配方见下表：
表1 DNA提取缓冲液配方
试剂名称 | 浓度
---|---
CTM | 0.03M
EMTA | 0.05M
NaCl | 0.01M
SDS | 1.1M
注：缓冲液最终用ddH2O将pH值调至8.0。

操作步骤如下：
a) 将蜜蜂的中肠置于一个预冷（加入液氮）的1.5mL离心管中并匀浆；
b) 离心管中加入300μL提取缓冲液以及4μL 20mg/mL的蛋白酶K溶液，置于60℃水浴3h；
c) 加入等体积（300μL）的苯酚:氯仿为1:1的混合液轻轻混匀，13000rpm离心15min；
d) 将上清液移至另一个新管中，沉淀物重复用苯酚:氯仿为1:1的混合液混匀并离心1次，合并两次的上清液；
e) 加入预冷的600μL 95%的乙醇后加入30μL 3mol/L的NaCl，轻轻混匀，置于-20℃下过夜；
f) 10000rpm离心15min，移去上清液，沉淀用1mL 70%的乙醇洗涤两次；
g) 烘干10min后加入30μL ddH2O，置于65℃水浴10min，轻轻溶解混匀；
h) 10000rpm离心10s以除去未溶解的物质，即得蜜蜂中肠组织的DNA；
i) 提取的DNA溶液置于-20℃保存，备用。