饲料中三聚氰胺快速检测 酶联免疫吸附法 DB35/T1276-2012 前言 本标准根据GB/T1.1-2009给出的规则编写，由福建省农业厅提出并归口。主要起草单位：福建蓝昊生物技术有限公司、国家加工食品质量监督检验中心（福州）、福建出入境检验检疫局。主要起草人：李昊、郑小严、陈健、翁惠玲、王天西、林钦、何孟杭、沈晓妙、高小尧、饶平凡。 1. 范围 本标准规定了饲料中三聚氰胺的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，适用于饲料原料、预混合饲料、配合饲料、浓缩饲料中三聚氰胺的测定。本方法的定量测定检出限为0.01mg/kg。 2. 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 - GB/T20195 动物饲料试样的制备 3. 原理 试样中三聚氰胺、酶标三聚氰胺抗原与包被于微量反应板中的三聚氰胺抗体进行免疫竞争反应，加入酶底物后显色，试样中三聚氰胺含量与颜色深度成反比，用目测法与三聚氰胺标准系列进行半定量检测，用仪器法进行定量检测。 4. 试剂和材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.1 三聚氰胺酶联免疫试剂盒中的试剂 - 4.1.1 包被抗三聚氰胺抗体的聚苯乙烯微量反应板 - 4.1.2 样品稀释液：0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液 - 4.1.3 三聚氰胺标准溶液：准确称取0.1000g三聚氰胺加甲醇溶解，并用甲醇定容至100mL，配制成1mg/mL三聚氰胺标准溶液 - 4.1.4 三聚氰胺酶标记物：三聚氰胺-辣根过氧化物酶交联物 - 4.1.5 清洗液：吸取0.5mL吐温-20于1000mL样品稀释液中 - 4.1.6 底物溶液：3,35,5-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液 - 4.1.7 反应终止液：硫酸溶液，c(H2SO4)=1mol/L 5. 仪器和设备 - 5.1 小型粉碎机 - 5.2 分析天平：感量0.0001g和0.01g - 5.3 离心管：15mL - 5.4 涡旋混合器 - 5.5 离心机 - 5.6 酶标测定仪：内置450nm和630nm滤光片 - 5.7 移液器及配套吸头：20μL-1000μL 6. 分析步骤 6.1 试样制备 按GB/T20195规定进行饲料试样制备。 6.2 试样提取 - 6.2.1 称取1g（精确至0.01g）试样，置于15mL离心管中，加入样品稀释液5mL和正已烷5mL，在涡旋混合器上振荡1min，3500rpm离心15min - 6.2.2 用移液器移去上层悬浊液，再用移液器吸取下层溶液100μL至1.5mL离心管中，加入样品稀释液500μL备用。 6.3 测定步骤 - 6.3.1 试剂平衡：将测试盒于室温中放置30min - 6.3.2 测定： - 6.3.2.1 在微量反应板中各孔，分别加入三聚氰胺标准溶液和完成提取的试样溶液各100μL，再每孔加入50μL三聚氰胺酶标记物，轻轻平晃反应板，室温（20℃~28℃）避光静置反应50min - 6.3.2.2 将反应板中反应液甩干，每孔加200μL清洗液洗板3次，每次洗板2min，甩掉清洗液，在吸水纸上拍干 - 6.3.2.3 每孔各加100μL底物溶液，轻轻平反应板，室温（20℃~28℃）避光静置反应20min，每孔加100μL反应终止液，在10~30min内测定 6.3.3 结果判定 - 6.3.3.1 目测法：比较试样液孔与标准溶液孔的颜色，若试样液孔颜色比标准溶液孔颜色浅，则为试样液中三聚氰胺含量超过标准溶液三聚氰胺含量，反之则未超过 - 6.3.3.2 仪器法：用酶标测定仪，在单波长450nm或双波长450nm/630nm进行测定