ICS 11.220 B41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 2841—2016 鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR检测方法 Detection method on duck Tembusu virus by semi-nested RT-PCR 2016-09-18发布 2016-10-18实施 山东省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、陈浩、冯强、提金风。 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒半套式RT-PCR（反转录-聚合酶链式反应）检测方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤及结果判定等内容。 本标准适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和禽胚尿囊液中坦布苏病毒核酸，也适用于鹅及其他动物坦布苏病毒核酸的检测。 2 实验室条件 2.1 仪器 生物安全柜、PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器等。 2.2 操作区域 样品操作区应具备生物安全设施。样品操作区、RNA提取区、PCR扩增区、电泳区应单向流动，不得逆向操作。电泳区应与其他区域相互隔离。 2.3 操作者 操作者应接受实验室生物安全及分子生物学检测技术培训，熟悉RNA防降解、防污染及溴化乙锭防护措施，并掌握RT-PCR结果判读方法。 3 试剂的准备 3.1 试剂 3.1.1 商品化RNA提取试剂盒。 3.1.2 rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）。 3.1.3 10×PCR Buffer。 3.1.4 M-MLV反转录酶（200 U/μL）。 3.1.5 5×M-MLV Buffer。 3.1.6 dNTPs（2.5 mmol/L，10 mmol/L）。 3.1.7 RNA酶抑制剂。 3.1.8 1.5%琼脂糖凝胶（见附录A.1）。 3.1.9 1×TAE缓冲液（见附录A.2）。 3.1.10 溴化乙锭（10 μg/μL）（见附录A.3）。 3.1.11 核酸电泳加样缓冲液（见附录A.4）。 3.1.12 DNA分子量标准（100 bp～2000 bp，至少5条指示条带）。 3.1.13 已知鸭坦布苏病毒鸭胚尿囊液阳性对照标准品。 3.1.14 阴性对照为高压灭菌蒸馏水。 3.2 引物 反转录随机引物：Random Primer（9 mer），浓度100 μmol/L。 检测引物： 上游引物5455F：5'-ATGGATGAAGCYCATTTCAC-3'； 下游内侧引物5371R：5'-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3'； 下游外侧引物5861R：5'-AGCACACGGCAATCTCAT-3'。 扩增片段长度为277 bp。引物浓度均为100 μmol/L。 4 操作程序 4.1 样品的采集和处理 4.1.1 样品采集 死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，可分别或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。 4.1.2 样品保存 样品应置于含抗生素的pH 7.0～7.4等渗磷酸盐缓冲液（PBS）中，无PBS时可用25%～50%甘油盐水。抗生素包括青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL），加入后pH调至7.0～7.4。样品室温放置1～2 h内应尽快处理，不能处理的4℃保存24 h，或-70℃长期保存。 4.1.3 病料处理 在生物安全柜中操作。咽喉或泄殖腔拭子置于200 μL含抗生素PBS中；组织样品制备10%～20%悬液。样品8000 r/min离心10 min，取上清液作为检测材料。 4.2 对照设置 每次检测应设置阳性对照和阴性对照，至少各一个。 4.3 RNA提取 按RNA提取试剂盒说明书操作，提取样品及对照RNA。提取后应立即检测或-70℃保存。 4.4 反转录反应体系 RNA 5 μL，5×M-MLV Buffer 2 μL，随机引物1 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，M-MLV反转录酶1 μL，总体系10 μL。