ICS 65.020.20 B04 DB12 天津市地方标准 DB12/T843—2018 绿豆源成分检测定性PCR法 发布：2018-11-07 实施：2018-12-01 天津市市场和质量监督管理委员会发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草，由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、陈笑芸、王成、赵新、兰璞、王永、王庆平、汪小福、黄凤军、秦志扬。 1 范围 本标准规定了绿豆源成分的定性PCR检测方法的原理、试剂和材料、仪器、分析步骤、结果分析和表述、检出限等内容。 本标准适用于绿豆源成分的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 绿豆源成分特异性序列 指本标准绿豆源成分特异性序列位于绿豆第5号染色体。 4 原理 根据绿豆源特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段，判断样品中是否含有绿豆源成分。 5 试剂和材料 5.1 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。 5.2 1mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入8.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。 5.3 CTAB-A buffer：将4g十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、16.4g氯化钠（NaCl）、3.15g三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、1.5g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）依次加入到100mL无菌去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液（见5.1）调pH至8.0，加水定容至200mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌15min。 5.4 CTAB-B buffer：将1g十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、0.5g氯化钠（NaCl）依次加入到100mL无菌去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液（见5.1）调pH至8.0，加水定容至200mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌15min。 5.5 1.2mmol/L NaCl溶液：将7g氯化钠（NaCl）溶于100mL无菌去离子水中。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌15min。 5.6 70%乙醇：将737mL 95%乙醇，加水定容至1000mL。 5.7 500mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.1）直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液（见5.1）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 5.8 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 5.9 TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（见5.7）和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.6），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 5.10 琼脂糖。 5.11 10g/L溴化乙锭（EB）溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于100mL水中，避光保存。溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 5.12 50×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.6），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。 5.13 加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯睛蓝，加10mL水溶解。