ICS 65.020 B30 备案号：52559-2017 重庆市地方标准 DB50/T745—2016 竹根姜无菌种苗生产技术规程 Technique regulation for production of pathogen-free seedlings of Zingiber officinale cv. Zhugen 2016-12-30发布 2017-05-01实施 重庆市质量技术监督局发布 前言 本标准依据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准结构和编写规则》编写。本标准由重庆市农业委员会提出，由重庆市农业委员会种植业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：重庆文理学院、重庆市天沛农业科技有限公司、重庆市农业技术推广总站、重庆市幅沅众创农业开发有限公司。 本标准起草人：刘奕清、李洪海、董鹏、黄科、廖钦洪、黄登艳、唐建民、况觅、袁海英。 1 范围 本标准规定了竹根姜无菌种苗生产、病菌检测方法、包装与运输等要求。 本标准适用于竹根姜无菌种苗生产全过程，要求种苗不携带姜瘟病病菌（Ralstonia solanacearum）和基腐病病菌（Pythium myriotylum）。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程 NY/T 402 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 NY/T 404 脱毒生姜种姜（苗）病毒检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 无菌种苗 采用茎尖离体培养获得的试管苗，经检测确认不携带病原菌的竹根姜种苗。 3.2 无菌材料 通过茎尖培养诱导获得的不定芽，经16SrDNA检测不带规定病原菌的材料。 4 无菌种苗的生产 4.1 无菌材料的培养 4.1.1 材料选取 选取无病虫害、品种纯正、健壮的姜种进行催芽，当幼芽长至约2 cm时，切取约1 cm长的顶芽。 4.1.2 顶芽消毒及培养 4.1.2.1 顶芽消毒 顶芽用1%升汞溶液浸泡10 min，在超净工作台上剥去表面2～3层鳞片，获得0.3 mm～0.5 mm大小的茎尖。 4.1.2.2 茎尖培养 将茎尖接种于培养基上进行培养（培养基见附录B）。 4.1.2.3 培养条件 培养温度为25℃±1℃，光照强度1500 LUX，每日光照9 h～10 h。 4.1.2.4 培养管理 定期清除真菌和细菌污染源。 4.1.2.5 不定芽形成 培养25 d～35 d后形成1.5 cm～2.5 cm高的不定芽。 4.1.2.6 增殖培养 将不定芽去顶切割至约0.5 cm进行增殖培养，每30 d继代一次，获得无菌材料。 4.2 无菌材料的检测 4.2.1 检测方法 采用16SrDNA检测方法，抽样方法按NY/T 404执行。 4.2.2 仪器和用具 主要包括高压锅、超净工作台、PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统。 4.2.3 无菌材料判定 不定芽增殖至一定数量后进行检测，连续三次检测结果为阴性者判定为无菌材料。 4.2.4 不合格材料处理 不合格材料应在121℃、101 kPa条件下灭菌15 min后销毁。 4.3 扩繁培养 经检测合格的无菌材料在增殖培养基中进行扩繁，每30 d继代一次，扩繁代数按NY/T 2306执行。 4.4 扩繁材料检测 采用16SrDNA方法检测，抽样方法按NY/T 404执行。 4.5 生根培养 选取茎直径2 mm以上、苗高3 cm以上的不定芽进行生根培养，约25 d形成生根苗。 4.6 驯化与移栽 4.6.1 基质 草炭土与珍珠岩按8:2混合，湿度控制在60%～70%。 4.6.2 炼苗 将具有4～6条根、根长约1 cm、株高约3 cm的组培苗移入温室炼苗5 d～7 d。 4.6.3 移栽 将基质装入128孔穴盘，打孔后移栽生根苗，浇定根水并覆盖薄膜保湿约7 d，随后揭膜。 4.6.4 管护 移栽后按相关技术规范进行管理。