ICS 65.120 B46 DB43 湖南省地方标准 DB43/T 790—2013 饲料中己烯雌酚的测定 酶联免疫吸附法 Determination of Diethylstilbestrol in Feed Enzyme-linked Immunosorbent Assay 2013-08-15发布 湖南省质量技术监督局发布 2013-10-15实施 目次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 原理 4 试剂与材料 5 仪器与设备 6 采样 7 试样的制备 8 提取与测定 9 结果计算 10 结果判断 11 灵敏度、准确度、精密度 前言 本标准按GB/T 1.1—2009的规则编制。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。本标准起草单位：湖南省兽药饲料监察所、湖南省畜禽水产品质量检验检测中心。本标准主要起草人：国光伟、陈启友、武深树、肖安东、宋跃君、周汝顺、邓肪、张俊波、雷佳。 1 范围 本标准规定了饲料中己烯雌酚酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料中己烯雌酚的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 国家实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 原理 通过抗原抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，经酶标仪测定其吸光度，计算试样中己烯雌酚的含量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682二级水的规定。 4.1 己烯雌酚标准品。 4.2 竞争酶标免疫法己烯雌酚试剂盒（2～8）℃冰箱中保存，包括： 4.2.1 酶标板 4.2.2 酶标记物 4.2.3 己烯雌酚标准溶液 4.2.4 己烯雌酚抗体浓缩液 4.2.5 底物溶液 4.2.6 显色溶液 4.2.7 终止液 4.3 乙腈 4.4 磷酸 5 仪器与设备 5.1 酶标仪（配相应滤光片） 5.2 氮气吹干装置 5.3 振荡器 5.4 样品粉碎机 5.5 冷冻离心机 5.6 分析天平：感量0.01 g 5.7 分析天平：感量0.00001 g 5.8 微移液器：20 μL、50 μL、100 μL、1000 μL 6 采样 按GB/T 14699.1的规定执行。 7 试样的制备 按GB/T 20195的规定执行。取制备好的供试试样作为供试试料；取制备好的空白试样作为阴性试料；取制备好的空白试样并添加适宜浓度的标准溶液作为阳性添加回收试样。 8 提取与测定 样品的提取与测定按试剂盒说明的要求执行。 9 结果计算 所获得的标准溶液或供试样品的平均吸光度值除以零浓度标准溶液的平均吸光度值再乘以100%，得到以百分比表示的吸光度值： 百分吸光度值 = B / B0 × 100% 式中：B为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；B0为零浓度标准溶液的平均吸光度值。 以标准溶液中己烯雌酚浓度（ng/mL）的自然对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，求出回归曲线方程，计算供试液中己烯雌酚的浓度。如有专业计算机软件，可直接求出供试液中己烯雌酚的浓度。饲料中的浓度按实际稀释倍数计算。 10 结果判断 10.1 实验有效性判定 标准曲线应线性良好，R²≥0.9900。阴性试料不得呈己烯雌酚阳性（或假阳性率≤5%）。