ICS 11.220 B41 备案号：41804-2014 吉林省地方标准 DB22/T 2010-2014 家畜（猪、牛、羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR法 (Detection of Hepatitis E virus by RT-PCR in Livestock (pig/cattle/sheep)) 2014-02-28发布 2014-04-30实施 发布单位：吉林省质量技术监督局 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：苏双、邵洪泽、许志林、程荣华、王楠、李琳、毛文智、王忠国、李文东。 警告 使用本标准的人员应具有正规实验室工作的实践经验。本标准未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了家畜（猪、牛、羊）戊型肝炎病毒RT-PCR测定方法。 本标准适用于猪、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV） 戊型肝炎病毒科成员，是一种单股正链RNA病毒，呈球形，直径约27～34 nm，无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。病毒基因组长约7.2 kb，含有3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）。其中ORF2位于3端，是主要的结构基因编码区，可编码核衣壳蛋白。 3.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） PCR技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法，由变性、复性和延伸三个步骤构成一个循环，通过多次循环使目标DNA大量扩增。 3.3 反转录（reverse transcription，RT） 反转录是以RNA为模板合成互补DNA（cDNA）的过程。 4 试剂与材料 4.1 引物 引物序列见表1，引物浓度为25 mmol/L。 表1 特异性引物序列 外引物（第1次PCR引物）： HEV-1：5'-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3' HEV-2：5'-TGYTGGTTRTCRTARTCCTG-3' 内引物（第2次PCR引物）： HEV-3：5'-ATWCATGGVTCRCCTGTGAA-3' HEV-4：5'-AAATYAATTCTGTCGGRAGC-3' 注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/C/T，V=A/C/G。 4.2 试剂 4.2.1 RNA提取试剂盒 4.2.2 RT-PCR试剂盒 4.2.3 DNA分子质量标准（DNA Marker） 扩增片段长度分别为524 bp和328 bp。DNA分子质量标准可采用100 bp DNA Ladder Marker、DNA Marker DL2000或其他等效产品。 4.2.4 其他试剂 4.2.4.1 双蒸水：符合GB/T 6682中二级水要求； 4.2.4.2 0.1% DEPC水：见附录A； 4.2.4.3 75%乙醇：见附录A； 4.2.4.4 10 mg/mL溴化乙锭（EB）或其替代品：见附录A； 4.2.4.5 凝胶加样缓冲液：见附录A； 4.2.4.6 1×Tris-硼酸电泳缓冲液：见附录A； 4.2.4.7 灭菌1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录A。 4.3 材料 4.3.1 一次性无菌手套或乳胶手套； 4.3.2 1.5 mL离心管； 4.3.3 0.2 mL PCR反应管； 4.3.4 琼脂糖； 4.3.5 500 mL量筒； 4.3.6 500 mL锥形瓶； 4.3.7 吸头； 4.3.8 眼科剪； 4.3.9 眼科镊； 4.3.10 称量纸。 5 仪器设备 5.1 PCR仪； 5.2 电泳仪。