ICS 65.020 B16 DB35 福建省地方标准 DB35/T 1280—2012 大豆疫霉菌分子检测技术规程 Standard protocol for molecular detection of Phytophthora sojae 2012-11-02发布 2013-02-01实施 福建省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009的要求编写。本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：陈庆河、翁启勇、李本金、兰成忠、赵健、邱荣洲。 1 范围 本标准规定了大豆疫霉菌PCR检测的样品制备、检测技术和操作程序。 本标准适用于大豆植物组织及土壤中大豆疫霉菌的分子检测。 2 规范性引用文件 （此处原文未提供具体引用文件内容） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 巢式PCR（nested PCR） 是指利用两套PCR引物（巢式引物）对目标序列进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用于产生扩增产物；该产物在内引物的作用下进行第二轮扩增。由于巢式PCR包含两次扩增反应，从而降低扩增多个靶位点的可能性，提高检测的敏感性，同时由于存在两对引物与模板的配对关系，也增强了检测的特异性。 4 原理 大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）隶属鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属，为真核生物。 真核生物核糖体基因包括5S、5.8S、18S、25S在内的4个rDNA基因，位于细胞核染色体上，属于多拷贝、中度重复序列。由于其进化速率较慢，常用于科级及以上分类的研究、检测和鉴定。 核糖体基因转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）是介于18S rDNA、5.8S rDNA和25S rDNA之间的区域，该区域进化速率较编码区更快。研究表明，ITS在真菌种间存在丰富变异，而在种内不同菌株间相对保守，因此可作为病原菌分子检测的理想靶序列。 根据大豆疫霉菌ITS的特异序列，设计特异性引物，可获得大豆疫霉菌特异扩增片段，用于其快速分子检测。 5 材料与试剂 5.1 主要仪器与器材 5.1.1 PCR检测仪 5.1.2 凝胶成像仪 5.1.3 台式离心机 5.1.4 涡旋混匀器 5.1.5 电泳仪 5.2 主要试剂 包括苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇、二甲基亚砜、氢氧化钠、脱脂奶粉及PCR常规试剂等。 6 采样 6.1 采样工具 使用符合要求的采样工具进行样品采集。 6.2 样品采集 6.2.1 大豆植株 6.2.2 土壤 6.3 样品贮运 样品采集后应妥善运输，避免污染和变质。 6.4 样品存放 样品应在适宜条件下保存，以保证检测结果的准确性。 7 操作方法 7.1 样本DNA制备 7.1.1 植物组织中病原菌DNA的提取 7.1.2 土壤中DNA的提取 7.1.3 DNA的保存 7.2 检测 7.2.1 加样 7.2.2 PCR检测 7.2.2.1 反应体系 7.2.2.2 反应条件 7.2.3 套式PCR检测 7.2.3.1 套式PCR模板DNA制备 7.2.3.2 套式PCR反应体系 7.2.3.3 套式PCR反应条件 7.3 琼脂糖凝胶电泳 8 结果判定 8.1 PCR检测结果判定 8.2 套式PCR结果判定 9 样品处理 附录A（资料性附录）大豆疫霉菌样本检测报告 附录B（资料性附录）大豆疫霉PCR检测试剂