DB12/T1006—2020 茄子黄萎病菌土壤带菌PCR检测技术规程
Technical regulation of PCR detection for verticillium dahliae in soil

发布日期：2020-12-17
实施日期：2021-01-16
发布单位：天津市市场监督管理委员会
归口单位：天津市农业农村委员会

前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市植物保护研究所。
本标准主要起草人：高苇、王勇、杨利娟、贡海燕、张春祥、刘晓琳、姚玉荣、王万立。

1 范围
本标准规定了茄子黄萎病菌的PCR检测的仪器和试剂、主壤取样、PCR检测、结果判定、土样及资料保存。本标准适用于土壤中茄子黄萎病菌的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）均适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T36197-2018 土壤质量土壤采样技术指南
GB/T36199-2018 土壤质量土壤采样程序设计指南

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 茄子黄萎病菌 (Verticillium dahliae Kleb.)
茄子黄萎病菌（大丽轮枝菌）可以侵染多种植物引起一种土传的维管束病害，病菌可在土壤中长期存活，是茄果类作物生产中危害最为严重的一种土传病害。茄子黄萎病菌的基本信息参见附录A。
3.2 微菌核 (Microsclerotia)
茄子黄萎病菌生长过程中，一条或多条菌丝体膨大、细胞壁增厚后，多向芽殖而形成的多细胞结构，该结构为肉眼可见的黑色菌丝颗粒。
3.3 土壤带菌 (Soil-borne)
土壤中携带能够诱发侵染植株发病的病原菌。

4 仪器和试剂
4.1 主要仪器
涡旋振荡仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、聚合酶链式反应仪（PCR仪）、水浴锅、电子天平（感量0.1g和0.1mg）、电泳仪、凝胶成像仪。
4.2 主要试剂
水饱和酚、三氯甲烷、液氮、异丙醇、无水乙醇、DNA荧光染料（GelRed）、Tris-HCl等。DNA分子量标准（DNA Marker，能够区分100bp～1000bp的DNA片段）。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）抽提液：2% CTAB，100 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0），20 mmol/L EDTA（pH 8.0），1.4 mol/L 氯化钠。
PCR反应混合物：2×MasterMix：Taq DNA聚合酶，2×PCR反应缓冲液，dNTP混合物等。10×TAE电泳缓冲液：242g Tris-base，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）加蒸馏水至1000mL，使用时稀释10倍。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682要求。

5 待测土壤取样
土壤采样按照GB/T36199-2018和GB/T36197-2018的有关要求进行，每块栽培地（面积667m²左右）按照“S”采样法设置15个采样点，使用不锈钢土壤取样器采集0～40cm耕层土样，将所有采样点土壤混匀后放入采样袋中。

6 检测与鉴定
6.1 土壤样品预处理
将采集的土壤样品送回实验室后，打开采样袋在室内自然风干（自然风干时间不能超过24h），然后采用2mm孔径的王壤筛过滤主壤，过滤后的土样进行检测。
6.2 样品总DNA的提取
每个样品设置3个重复、3个平行，每个重复称取1g土样，放入灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨。向研钵中加入4mL预热的CTAB抽提液，倒入15mL灭菌离心管中，反复震荡混合后，65℃水浴30min，4℃ 14000g离心10min，保留上清液。取上清液，加入等体积水饱和酚，充分混匀后，4℃ 14000g离心10min。取上清液，加等体积的三氯甲烷：异戊醇（24:1），4℃ 14000g离心10min。继续三氯甲烷：异戊醇（24:1）抽提，直至有机相和水相之间无蛋白层为止。吸取上清，加入2/3体积顶冷的异丙醇混匀，4℃ 14000g离心10min，可见DNA沉淀，弃去上清液，用70%冷乙醇漂洗DNA沉淀2次～3次，充分风干后溶解于适量去离子水中。
6.3 PCR检测
将得到的土壤DNA样品进行10倍、100倍和1000倍梯度稀释，将DNA原液和稀释后的各梯度DNA...