DB51/T2913—2022 大口黑鲈诺卡氏菌病诊断和防治技术规程
Specification for diagnosis and control of Nocardiosis in Largemouth Bass (*Micropterus salmoides*)

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：成都农业科技职业学院、四川农业大学、内江师范学院。本文件主要起草人：李成伟、耿毅、王均、贺扬、吴宏伟、刘海燕、王振华、李建臻、黎丽。本文件首次发布。

1 范围
本文件规定了大口黑鲈（*Micropterus salmoides*）养殖过程中发生的诺卡氏菌病的流行情况、发病症状、诺卡氏菌的分离培养、形态学鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA基因鉴定、特异性鉴定及其防治等技术规程。
本文件适用于大口黑鲈诺卡氏菌病的诊断和防治。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注明日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14926.43 实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂
GB/T 27623.1 渔用抗菌药物药效试验技术规范
NY 5051 无公害食品淡水养殖用水水质标准
SC/T 1132 渔药使用规范
SC/T 7014 水生动物检疫实验室技术规范
SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范
DB51/T 526 大口黑鲈养殖技术规范

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 大口黑鲈诺卡氏菌病 (Nocardiosis in largemouth bass)
指由诺卡氏菌感染大口黑鲈引起的一种细菌性传染病。

4 试剂和材料
4.1 水
用水符合 GB/T 6682-2008 中一级水规格。
4.2 试剂与培养基
革兰氏染液配制按照 GB/T 14926.43 中的规定执行。牛脑心浸液培养基（BHI）、50X TAE 缓冲液、1% 琼脂糖凝胶、七叶苷培养基、明胶培养基等相关配方见附录 A；细菌基因组 DNA 提取试剂盒、PCR 纯化试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂盒。
4.3 16S rRNA 扩增引物
16S rRNA 基因序列扩增引物：27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。
4.4 特异性鉴定引物
特异性鉴定上游引物 N5F1 (5'-TGAGCCTGAACTGCATGGTTC-3')，下游引物 N5R1 (5'-ACGGTATCGCAGCCCTCTGTA-3')。

5 设备和仪器
超净工作台、光学显微镜、PCR 仪、电泳仪、离心机、生化培养箱、恒温摇床培养箱、常规细菌接种器械（包括培养皿、酒精灯、接种环、酒精棉等）、4℃/-20℃ 冰箱等。

6 临床检查
6.1 流行情况
水温 15～32℃ 时都可流行。我省在每年 4 月底开始大规模爆发，直至 10 月均有该病流行，25～28℃ 为发病高峰期，死亡率高。
6.2 临床和解剖症状
患病鱼反应迟钝、离群独游、食欲下降，主要病变为体表出现溃疡灶以及出血点，在鳃丝、躯干皮下脂肪、肌肉、腹腔（包括肝、肾、脾、肠系膜）出现乳白色或黄色结节，结节大小通常直径 0.5~3mm；肝脏肿大、淤血，鱼腔内有积液等。

7 实验室样品采集
样品采集按 SC/T 13 中的规定执行。

8 细菌的分离与培养
用 75% 酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取肝脏、头肾、中肾和脾脏进行病原菌分离。
利用接种环，划线接种至 BHI 固体培养基，28℃ 恒温培养 7～12d，从形态一致的优势菌群中挑取单个菌落进一步纯化培养。

9 细菌的鉴定
9.1 形态学鉴定
9.1.1 菌落形态
分离病原菌在 BHI 固体培养基 28℃ 培养 7～12d 后观察菌落形态。
9.1.2 细菌形态