YC/T 149-2002
基本信息
标准号： YC/T 149-2002
中文名称：烟草及烟草制品 转基因的测定
标准类别：烟草行业标准(YC)
英文名称： Determination of genetically modified organisms in tobacco and tobacco products
标准状态：现行
发布日期：2002-09-12
实施日期：2002-12-01
出版语种：简体中文
下载格式：.rar.pdf
下载大小：305027
标准分类号
标准ICS号：农业>>65.160烟草、烟草制品和烟草工业设备
中标分类号：食品>>制烟>>X85制烟综合
关联标准
出版信息
出版社：中国标准出版社
书号：155066.2-14896
页数：11
标准价格：10.0 元
出版日期：2004-04-24
相关单位信息
起草单位：全国烟草标准化技术委员会
归口单位：全国烟草标准化技术委员会
发布部门：国家烟草专卖局
标准简介
本标准规定了烟草及烟草制品转基因的测定方法。本标准适用于烟草及烟草制品。 YC/T 149-2002 烟草及烟草制品 转基因的测定 YC/T149-2002 标准下载解压密码：www.bzxz.net
标准图片预览
标准内容
ICS65.160
备案号：10586—2002
中华人民共和国烟草行业标准
YC/T 149-2002
烟草及烟草制品
转基因的测定
Tobacco and its product-
Determination of genetically modified organism2002-09~12 发布
国家烟草专卖局
2002-12-01实施
YC/T149—2002
本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人：焦庆明、郭兆奎、闫新甫、万秀清、于艳华、魏继承。648
1范围
转基因的测定
烟草及烟草制品
本标准规定了烟草及烟草制品转基因的测定方法。本标准适用于烟草及烟草制品。2术语和定义www.bzxz.net
下列术语和定义适用于本标准。2.1
genetic engineering
基因工程
YC/T 149—2002
利用载体系统的重组DNA技术，以及利用物理、化学和生物等方法把重组DNA导人有机体的技术。
转基因烟草genetically modified tobacco利用基因工程的遗传操作获得的烟草，不包括自然发生、人工选择和杂交育种技术得到的烟草不包括化学或物理方法诱变得到的烟草；不包括通过器官、组织或细胞培养及原生质体融合、染色体倍性操作得到的烟草。
3实验室要求
3.1实验室空间设计
应在相互隔离的不同实验室进行样品前处理、DNA提取、PCR反应、试剂配制和凝胶观察等操作，并定期对实验室进行紫外过夜照射。3.2操作要求
试验室台面使用前后利用次氯酸钠擦拭消毒，样品研磨在强力通风橱中进行；PCR反应液加样在超净工作台内进行；样品准备过程中每个样品操作更换一次塑料手套；样品的称量不可在称量试剂的天平室内进行，应设专用天平以免污染试剂。3.3样品重复
将每个待测样品随机分成两组，每组分别进行DNA提取和PCR分析。3.4对照样品
3.4.1阳性对照
阳性标推样品是配制为已知含量的转基因烟草样品，确定其含量分别为0.1%、0.5%、1%、2%、5%。
3.4.2阴性对照
阴性对照是事先检测为非转基因的烟草样品。3.4.3试剂对照
该对照中不含烟草样品，与样品一起利用相同的程序进行各种试剂的处理操作，用以控制反应试剂对试验结果的影响。
YC/T 149—2002
3.4.4提取空白
从样品研磨到提取结束，将两个离心管放在工作区内，与样品DNA一起进行PCR扩增，以确定交叉污染的可能性。
3.5PCR扩增结果观察
在每一次PCR反应中，只有当所有的对照都表现正常时，才能认可电泳结果，此时阳性样品在特定位置出现一条带，而其他位置及阴性对照和空白对照都没有扩增条带。若任何对照出现异常，要重新进行检测，以避免假性结果。
3.6防止污染
所有用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都必须进行灭菌处理，移液器枪头和各种离心管只能一次性使用，工作台面和操作间用过后进行紫外线过夜照射，样品前处理及研磨要在通风橱中进行，并带一次性手套。
3.7安全防护
在整个试验操作过程中都必须穿着工作服和手套，特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。
4试剂
4.1化学试剂
以下试剂均为分析纯以上纯度等级。4. 1. 1
十六烷基三甲基溴化胺 CTAB。
兰氯甲烷。
乙二胺四乙酸二钠 NazEDTA。
乙醇。
氟化钠。
三羟甲基氨基甲烷碱 Tris Base。乙烯吡咯烷酮PVP-40。
异戊醇。
琼脂糖。
硼酸。
溴酚蓝。
冰乙酸。
溴乙锭。
乙酸钠。
盐酸。
柠檬酸钠。
十二烷基硫酸钠SDS。
4.2生物化学试剂
4.2.1 PCR Markel。
Taq DNA 酶 2 u/μL.
4.2.3限制性内切酶Asp700(Xmn1),Nsil。4.3缓冲液
4. 3. 1 CTAB 提取缓冲液(pH8)含 CTAB(g=20 g/L)、NaCl(c =1. 4 mol/L)、Tris(c=0. 1 mol/L)和Na,EDTA(c=20 mmol/L)。
4.3.2CTAB沉淀缓冲液含CTAB(g=5g/L)和NaCl(c=0.04mol/L)。4.3.3高盐TE含NaCl(c=1.2mol/L)。650
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4.3.4DNTPs 含 dATP、dCTP、dTTP 和dGTP各 2.5 mmol/L。4.3. 5 AE 缓冲液(pH7. 85)含 Tris(c = 40 mmol/L)、乙酸钠(c=20 mmoi/L)和 NazEDTA(c =2 mmol/L)。
4. 3. 6 TBE 缓冲液(pH8. 0)含 Tris/硼酸(c=45 mmol/L)和 NazEDTA(c=1 mmol/L)。4.3.7标记的DNA探针。
4.3.82XSSC缓冲液(pH7.0)含NaCI(c=3mol/L)和乙酸钠(c=0.5mol/L)。4. 3. 9 预杂交液(5 倍液,pH7. 0)含 N-sarcosin(g1 g/L)和 SDS(g=0. 2 g/L)。4.3.10洗膜液1：SSC缓冲液(2倍液,pH7.0)含NaCl(c=3mol/L）、乙酸钠(c=0. 3mol/L)和SDS(q=1 g/l.)。
4.3.11洗膜液2SSC缓冲液(0. 1倍液，pH7. 0)含NaCl(c=3mol/L)、乙酸钠(c=0.3mol /L)和SDS(q=1 g/L)。
5仪器与耗材
5.1高速冷冻离心机（最高转数30000r/min）5.2涡旋振荡器
5.3紫外分光光度计
5.4恒温水浴锅
5.5电子分析关平（感量0.0001g）5.6微量离心机
5.7PCR仪
5.8电泳系统
5.9紫外分析仪
5.10恒温水浴锅
5.11尼龙膜
杂交箱
２mL离心管
5.14移液枪头
0.20mL薄壁PCR应管
6样品的取样方法
6.1鲜烟叶
以品种和种子产地为取样单位，随机取样，每个样品在10个不同地块各取一个嫩芽或叶片，自然失水2d后，编号注明品种名称、种子来源、取样地点。6.2初烤烟（把烟）
6. 2. 1 数量
以检验批（产地）为单位，每一检验批的产地和等级应是相同的，50件以下取2件，51～100件取4件，101150件取5件，151～200件取6件，200件以上每增加50件（不足50件按50件计）增取1件，各取叶片少许，混合作为一个样品。6.2.2方法
打开一件烟叶的一端，分左中右三个部位用长简状取样器（具尖筒内径1cm）随机取3点，该批次的每件所取的样品用四分法缩分出均勾样品2份（每份250g）作实验室样品供检验和复检，实验室样品必须密封并填写标签，注明产地、等级报验号、送样单位、取样人。651
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6.3机打片烟
对于已装箱的机打片烟，以箱（内装200kg烟叶）为取样单位，用长简状取样器，每箱随机取约2g烟叶，将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200g烟叶作为一个检测样品；也可在复烤加工车间，结合水分测定取样，注明烟叶产地、等级和箱号。6.4卷烟
按照IS08243《卷烟一抽样》中规定的方法进行抽样。7烟叶样品DNA提取方法
7.1样品前处理
7.1.1鲜烟叶
随机取鲜叶样品约1g，在研钵内加液氮研磨成粉末，转人称量的1.5mL离心管中，再称量确定叶片组织质量。
7.1.2 烤后烟叶
随机取烟叶样品约20g，用硫酸纸包好，放人纸袋中，置方盘加盖后，40C恒温箱中过夜使其干燥，在灭菌的研钵中研成粉末，存于20ml离心管中，从中取约100mg分别放人两个1.5mL离心管中。7.2DNA提取
7.2.1鲜烟叶
7.2.1.1取100mg液氮研磨后的粉末，加人100uL2×CTAB提取缓冲液，充分混匀后在65C中水浴 10 min。
7.2.1.2加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1），混匀后在12000r/min离心4min。7.2.1.3取上清液，加1/10体积的10×CTAB提取缓冲液，加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1），混匀在12000r/min下离心4min。取上清，加等体积CTAB沉淀缓冲液，混匀15000r/min下离心8min。7.2.1.4耳
去上清，沉淀加100μL高盐TE，65C水浴10min。7.2. 1.5
加人二倍体积的冷无水乙醇（一20C冰箱贮存），一40C冷置30min。7. 2. 1. 7
15000r/min离心8min，沉淀溶于70uL超纯水中。7.2.2烤后烟叶
7.2.2.1向内盛待测样品的1.5mL离心管中，加人700μL0.75×CTAB抽提缓冲液，振荡混匀后，65c的恒温水浴10min。
7.2.2.2加700μul.三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1)，混匀12000r/min离心5min。7.2.2.3取上清液，加1/10体积的10%CTAB提取缓冲液，加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1），混匀后在12000r/min离心5min。7.2.2.4取上清，加等体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀后在15000r/min离心8min。7.2.2.5去上清，加100uL高盐TE缓冲液，65C水浴10min。7.2.2.6加人二倍体积冷无水乙醇，于-40℃冷置30min。7.2.2.715000r/min离心8min，沉淀溶于50μL超纯水中。7.3DNA含量和纯度的测定
7.3.1紫外区波长扫描
烟叶DNA提取物的产量和纯度用紫外分光光度计波长在220nm～320nm之间扫描测定。7.3.1.1用超纯水将紫外分光光度计调零，校正基线。7.3.1.2将10μLDNA提取液加人比色m中，加超纯水1990μL后，移液器抽打混匀，进行220nm~320nm波长扫描。
7.3.1.3提取的DNA产量以260nm下的吸光值来计算，OD值为1相当于每毫升溶液中含有50μg双链DNA。
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7.3.1.4DNA提取物纯度用OD260/280的值来估算，比值在1.7～1.9为纯度较好，比值大于1.9提取的DNA中含RNA，比值小于1.7提取液中含一些蛋白质等杂质，要重新提取DNA。7.3. 2硝酸还原酶基因序列 PCR 扩增所提取DNA质量可通过对其进行硝酸还原酶基因序列扩增来判定、号「物序列为：NR-1 GTG TCA TGA ACA GAT GGC TCNR-2 GAT TAC TCG TCG AGT GAA GA利用此引物扩增出来的硝酸还原酶基因序列长度为104bp，来确定提取的DNA能否作模板用于检测。
8转基因烟叶检测方法
8. 1共有序列引物的 PCR 检测
8.1.1引物设计
用于转基因烟草检测共有标志主要有：花耶菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌nos终止子序列和编码卡那霉素抗性基因(NPTII),根据这些核甘酸序列设计PCR引物进行烟草转基因检测。8.1.1.135S启动子序列扩增
35S-15'GCTCCTACAAATGCCATCA-335S-25'GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3该引物的扩增片段长度为195bp，作为转基因烟草检测的标志。8.1.1.2nos终止子序列扩增
n0s-15'GATTGAATCCTGTTGCCGGT-3'nos-25'GTAACATAGATGACACCGCG-3'该引物的扩增片段长度为213bp，作为转基因烟草检测的标志。8. 1. 1. 3 NPTII 基因序列扩增NPT-15'GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC-3'NPT-25'GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA-3'该引物的扩增片段长度为411bp，也可作为转基因烟草检测的标志。8.1.2PCR扩增体系
对于35S启动子序列引物35S-1、35S-2和nos终止子引物nos-1、nos-2和NPT-1、NPT-2可采用下列扩增体系进行扩增反应，按下列体系的摩尔数或浓度，根据所作扩增的管数，计算出各组分应加的总体积，在无菌室中加样，再分装至各个0.20mL扩增管中，然后按体系中模板设计的纳克数加人模板，加矿物油离心后放人PCR仪中扩增。表1PCR扩增体系
加样顺序
反应组分
10xbuffer
引物1
引物2
Taq酶
超纯水
DNA模板
总体积
浓度或体积（每个反应管）
220 μmol
25 pmol
25 pmol
37~38μl
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8.1.3PCR扩增条件
对于35S启动子序列引物35S-1、35S-2和nos终止子引物nos-1、nos-2和NPT-1、NPT-2可采用下列循环程序进行扩增：
预变性：95℃下5min；
循环设定：变性94℃，30s；
退火64℃，45s；
延伸72℃,45s；
循环次数：35个循环；
后延伸：72℃5min。
8.1.4电泳及凝胶观察
称琼脂糖溶于0.5×TBE缓冲液中，溶化制成1.5%凝胶，加EB(0.5μg/mL），温度降至45C时倒入放有梳子的凝胶模具中，冷凝后拔出梳子，放入水平电泳槽中，取10uL扩增产物加上样缓冲液（含溴酚蓝指示剂点样，以PCR Marker作为分子量标记进行电泳，紫外分析仪观察电泳结果。8. 2特异性基因序列的 PCR 检测8. 2. 1烟草普通花叶病毒外壳蛋白基因 TMV-CPTMV15'GTGTTCTTGTCATCAGCGTGGGC-3°TMV25'CACCGTTGCGTCGTCTACTCTACG-3'其PCR扩增产物片段长度为202bp8.2.2 黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)CMV15'-ACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAGCG-3'CMV25'-ACATAGCAGAGATGGCGGCAACG-31其PCR扩增产物片段长度为263bp。8.2.3马铃善 Y病毒外壳蛋白基因(PVY-CP)PVY1 5'-GATATTTCAAATACTCGGGCA-3'PVY25'-GCATAACGCGCTAAACCCAC-3其PCR扩增产物片段长度为362bp。8.2. 4烟草菁通花叶病毒复制酶基因(TMV54KD）T54D15'-GAGTTGTCTGGCATCATTGA-3T54D25'-ACAATGGTCAAAGCCGGGTA-3'其PCR扩增产物片段长度为295bp。8.2.5苏云金杆菌杀虫蛋白基因(BT)BT-1 5'CCCACTAGTTAACAATTTGATTGGA-3BT-25'CCGGAAGCTTTAGGACTGTAGGT-31其PCR扩增产物片段长度为299bp。8.3结果验证试验
如果样品的35S启动子和（或）nos终止子序列引物的PCR扩增出现阳性条带，在重新提取DNA，重复前述PCR 检测的同时应进行结果验证试验。8.3.1限制性内切酶酶切反应验证8.3.1.1PCR产物的纯化
将PCR产物移人另一灭菌的1.5mL离心管中，加100μL预冷的无水乙醇，沉淀PCR产物DNA片段，一80℃冷冻1h后，15000r/min离心8min，弃上清，乙醇挥发后加超纯水。654
8.3.1.2酶切反应
8.3.1.2.135S启动子
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对于出现35SPCR阳性反应样品，应通过Asp700(Xmn1）进行限制性内切酶酶切分析，方法是加5u的Asp700到10mL经纯化的PCR产物中，在37℃恒温水浴中培养3h，再进行1.2%琼脂糖电泳和紫外分析，如其195bp片段可被酶切戒115bp和80bp，则可确定为35S特异性扩增产物。8.3.1.2.2nos 终止子
对于呈nos引物PCR阳性反应的样品，利用限制性内切酶Nsil可将180bp的片段切成96bp和84bp的两条片段，方法与35S的酶切反应相同。8.3.2巢式或半巢式PCR反应验证对于PCR扩增片段亮度很弱或未出现的样品，应采用巢式或半巢式PCR方法设计引物对扩增产物进行第二次 PCR反应，以提高检测的灵敏度。巢式或半巢式PCR方法中，第二次扩增是以第一次扩增的产物为模板，引物的设计是根据第一一次扩增产物目标基因序列,使第二次扩增范围在第一次扩增片段范围内。8.3.2.135S 巢式 PCR
35S巢式PCR扩增产物片段长度为110bp。35S-nt-15'CGTTCACCCTAACTACACTAT-335S-nt-25'GTGACTGCCGTCTCCGTAGA-3'8.3.2.235S 半巢式 PCR
在35S半巢式PCR反应中第二次PCR中的一个引物与第一次PCR相同,另一引物位于第一次扩增片段内部，其扩增产物片段长度为134bp。35S-sn-15'ACAGTGGTCCCAAAGATGGA-3'35S-sn-25'GATAGTTGGGATTGTGCGTCA-3'8. 3. 2. 3 nos 终止子巢式 PCR以第一次扩增产物为模板，利用下面一对引物进行第二次扩增，扩增片段长度为104bp。nos-NT-15'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3nos-NT-25'CCCATCTCATAAATAACGTC-3'8.3.3探针杂交验证
探针杂交是特定序列已标记的单链DNA（探针）与另一个固定了的具有互补序列的DNA形成碱基配对，通过放射性自显影或化学发光方法，检测特定DNA序列的存在，试验操作如下；8.3.3.1探针标记：用切口平移化学荧光素标记和检测试剂盒制备碱性磷酸酶标记探针，荧光标记DNA 探针(H-35S-a1)序列为 5'-F1-GGGTCTTGCGAAGGATAGTG-3。8.3.3.2DNA片段转移：用毛细管法或真空转移法将DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
8.3.3.3探针杂交：用2×SSC润湿固定DNA的膜，加预杂交液20mL/100cm，在杂交温度50C下1h，以2.5mL/100cm膜杂交液代替预杂交液50℃C下4h，去除杂交液，用0.2×SSC/0.1%SDS洗两次，每次5min，然后在50C下用0.2×SSC/0.1%SDS洗20min。8.3.3.4DNA探针的检测：用Saran保鲜膜将湿润的膜包好，室温下放置过夜，尽量除去气泡，在用Vinyl覆盖的压片夹中，用MPX光片，室温下曝光4min～6min。8.3.4扩增产物的测序验证
利用扩增片段可包含目的基因的引物组35S1,nos2进行扩增，将片段长度大于1KB的条带回收，纯化并测序，确定所转基因的种类。655
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8.4转基因检测标准与定量PCR
8.4.1转基因检测定性标准
通过对30个标签样品（其中20个是含量为0.1%和0.5%的阳性样品，其余为阴性）的盲检，测出阳性和阴性检出率均为100%，证明利用本方法可以准确地检测含量在0.1%以上的阳性样品；而不致发生假阳性和阴性反应。确定0.1%为转基因检测阳性的定性标准，凡出现PCR特异条带亮度等于或高于0.1%参比对照亮度的样品，则确定为阳性条带，若弱于该亮度，则需重新提取IDNA重复检测。8.4.2转基因定量检测
8.4.2.1外标定量检测法
8.4.2.1.1标准样品制备
利用100%阳性和阴性材料制成已知含量的阳性样品（5%、2%、1%、0.5%和0.1%）。8.4.2.1.2PCR检测
提取待测样、阳性标准样品的DNA，按DNA模板量300ng，待测样品与标准样品在同-体系、同一扩增条件的同一次进行扩增，对比扩增后待测样品与标准物梯度电泳条带的亮度，确定待测样品阳性成分含量。
8.4.2.2内标定量检测法
8.4.2.2.1标准模板的制备
以转基因烟草为材料，通过重叠延伸扩增法制备插入20bp片段的35S启动子和nos终止子的竞争性模板。
8. 4.2.2.2 PCR 扩增
在PCR体系中按模板量500ng，通过预备试验确定与含阳性模板10%、5%、1%、0.5%和0.1%竞争PCR条带亮度相当的标准模板的拷贝数量，按此标准模板的量在反应液加人待测DNA的同时加人标准DNA模板，对比目标片段和各标准片段的亮度，确定待测样品中阳性含量。8.4.2.3实时PCR定量法
利用Taqman定量PCR测定仪（如ABIPRISM7700或Lightcycler）进行实时PCR定量测定。656
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烟草及烟草制品
转基因的测定
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2002-12-01实施
YC/T149—2002
本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人：焦庆明、郭兆奎、闫新甫、万秀清、于艳华、魏继承。648
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转基因的测定
烟草及烟草制品
本标准规定了烟草及烟草制品转基因的测定方法。本标准适用于烟草及烟草制品。2术语和定义www.bzxz.net
下列术语和定义适用于本标准。2.1
genetic engineering
基因工程
YC/T 149—2002
利用载体系统的重组DNA技术，以及利用物理、化学和生物等方法把重组DNA导人有机体的技术。
转基因烟草genetically modified tobacco利用基因工程的遗传操作获得的烟草，不包括自然发生、人工选择和杂交育种技术得到的烟草不包括化学或物理方法诱变得到的烟草；不包括通过器官、组织或细胞培养及原生质体融合、染色体倍性操作得到的烟草。
3实验室要求
3.1实验室空间设计
应在相互隔离的不同实验室进行样品前处理、DNA提取、PCR反应、试剂配制和凝胶观察等操作，并定期对实验室进行紫外过夜照射。3.2操作要求
试验室台面使用前后利用次氯酸钠擦拭消毒，样品研磨在强力通风橱中进行；PCR反应液加样在超净工作台内进行；样品准备过程中每个样品操作更换一次塑料手套；样品的称量不可在称量试剂的天平室内进行，应设专用天平以免污染试剂。3.3样品重复
将每个待测样品随机分成两组，每组分别进行DNA提取和PCR分析。3.4对照样品
3.4.1阳性对照
阳性标推样品是配制为已知含量的转基因烟草样品，确定其含量分别为0.1%、0.5%、1%、2%、5%。
3.4.2阴性对照
阴性对照是事先检测为非转基因的烟草样品。3.4.3试剂对照
该对照中不含烟草样品，与样品一起利用相同的程序进行各种试剂的处理操作，用以控制反应试剂对试验结果的影响。
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3.4.4提取空白
从样品研磨到提取结束，将两个离心管放在工作区内，与样品DNA一起进行PCR扩增，以确定交叉污染的可能性。
3.5PCR扩增结果观察
在每一次PCR反应中，只有当所有的对照都表现正常时，才能认可电泳结果，此时阳性样品在特定位置出现一条带，而其他位置及阴性对照和空白对照都没有扩增条带。若任何对照出现异常，要重新进行检测，以避免假性结果。
3.6防止污染
所有用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都必须进行灭菌处理，移液器枪头和各种离心管只能一次性使用，工作台面和操作间用过后进行紫外线过夜照射，样品前处理及研磨要在通风橱中进行，并带一次性手套。
3.7安全防护
在整个试验操作过程中都必须穿着工作服和手套，特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。
4试剂
4.1化学试剂
以下试剂均为分析纯以上纯度等级。4. 1. 1
十六烷基三甲基溴化胺 CTAB。
兰氯甲烷。
乙二胺四乙酸二钠 NazEDTA。
乙醇。
氟化钠。
三羟甲基氨基甲烷碱 Tris Base。乙烯吡咯烷酮PVP-40。
异戊醇。
琼脂糖。
硼酸。
溴酚蓝。
冰乙酸。
溴乙锭。
乙酸钠。
盐酸。
柠檬酸钠。
十二烷基硫酸钠SDS。
4.2生物化学试剂
4.2.1 PCR Markel。
Taq DNA 酶 2 u/μL.
4.2.3限制性内切酶Asp700(Xmn1),Nsil。4.3缓冲液
4. 3. 1 CTAB 提取缓冲液(pH8)含 CTAB(g=20 g/L)、NaCl(c =1. 4 mol/L)、Tris(c=0. 1 mol/L)和Na,EDTA(c=20 mmol/L)。
4.3.2CTAB沉淀缓冲液含CTAB(g=5g/L)和NaCl(c=0.04mol/L)。4.3.3高盐TE含NaCl(c=1.2mol/L)。650
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4.3.4DNTPs 含 dATP、dCTP、dTTP 和dGTP各 2.5 mmol/L。4.3. 5 AE 缓冲液(pH7. 85)含 Tris(c = 40 mmol/L)、乙酸钠(c=20 mmoi/L)和 NazEDTA(c =2 mmol/L)。
4. 3. 6 TBE 缓冲液(pH8. 0)含 Tris/硼酸(c=45 mmol/L)和 NazEDTA(c=1 mmol/L)。4.3.7标记的DNA探针。
4.3.82XSSC缓冲液(pH7.0)含NaCI(c=3mol/L)和乙酸钠(c=0.5mol/L)。4. 3. 9 预杂交液(5 倍液,pH7. 0)含 N-sarcosin(g1 g/L)和 SDS(g=0. 2 g/L)。4.3.10洗膜液1：SSC缓冲液(2倍液,pH7.0)含NaCl(c=3mol/L）、乙酸钠(c=0. 3mol/L)和SDS(q=1 g/l.)。
4.3.11洗膜液2SSC缓冲液(0. 1倍液，pH7. 0)含NaCl(c=3mol/L)、乙酸钠(c=0.3mol /L)和SDS(q=1 g/L)。
5仪器与耗材
5.1高速冷冻离心机（最高转数30000r/min）5.2涡旋振荡器
5.3紫外分光光度计
5.4恒温水浴锅
5.5电子分析关平（感量0.0001g）5.6微量离心机
5.7PCR仪
5.8电泳系统
5.9紫外分析仪
5.10恒温水浴锅
5.11尼龙膜
杂交箱
２mL离心管
5.14移液枪头
0.20mL薄壁PCR应管
6样品的取样方法
6.1鲜烟叶
以品种和种子产地为取样单位，随机取样，每个样品在10个不同地块各取一个嫩芽或叶片，自然失水2d后，编号注明品种名称、种子来源、取样地点。6.2初烤烟（把烟）
6. 2. 1 数量
以检验批（产地）为单位，每一检验批的产地和等级应是相同的，50件以下取2件，51～100件取4件，101150件取5件，151～200件取6件，200件以上每增加50件（不足50件按50件计）增取1件，各取叶片少许，混合作为一个样品。6.2.2方法
打开一件烟叶的一端，分左中右三个部位用长简状取样器（具尖筒内径1cm）随机取3点，该批次的每件所取的样品用四分法缩分出均勾样品2份（每份250g）作实验室样品供检验和复检，实验室样品必须密封并填写标签，注明产地、等级报验号、送样单位、取样人。651
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6.3机打片烟
对于已装箱的机打片烟，以箱（内装200kg烟叶）为取样单位，用长简状取样器，每箱随机取约2g烟叶，将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200g烟叶作为一个检测样品；也可在复烤加工车间，结合水分测定取样，注明烟叶产地、等级和箱号。6.4卷烟
按照IS08243《卷烟一抽样》中规定的方法进行抽样。7烟叶样品DNA提取方法
7.1样品前处理
7.1.1鲜烟叶
随机取鲜叶样品约1g，在研钵内加液氮研磨成粉末，转人称量的1.5mL离心管中，再称量确定叶片组织质量。
7.1.2 烤后烟叶
随机取烟叶样品约20g，用硫酸纸包好，放人纸袋中，置方盘加盖后，40C恒温箱中过夜使其干燥，在灭菌的研钵中研成粉末，存于20ml离心管中，从中取约100mg分别放人两个1.5mL离心管中。7.2DNA提取
7.2.1鲜烟叶
7.2.1.1取100mg液氮研磨后的粉末，加人100uL2×CTAB提取缓冲液，充分混匀后在65C中水浴 10 min。
7.2.1.2加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1），混匀后在12000r/min离心4min。7.2.1.3取上清液，加1/10体积的10×CTAB提取缓冲液，加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1），混匀在12000r/min下离心4min。取上清，加等体积CTAB沉淀缓冲液，混匀15000r/min下离心8min。7.2.1.4耳
去上清，沉淀加100μL高盐TE，65C水浴10min。7.2. 1.5
加人二倍体积的冷无水乙醇（一20C冰箱贮存），一40C冷置30min。7. 2. 1. 7
15000r/min离心8min，沉淀溶于70uL超纯水中。7.2.2烤后烟叶
7.2.2.1向内盛待测样品的1.5mL离心管中，加人700μL0.75×CTAB抽提缓冲液，振荡混匀后，65c的恒温水浴10min。
7.2.2.2加700μul.三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1)，混匀12000r/min离心5min。7.2.2.3取上清液，加1/10体积的10%CTAB提取缓冲液，加人等体积的三氯甲烷/异戊醇（体积分数为24：1），混匀后在12000r/min离心5min。7.2.2.4取上清，加等体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀后在15000r/min离心8min。7.2.2.5去上清，加100uL高盐TE缓冲液，65C水浴10min。7.2.2.6加人二倍体积冷无水乙醇，于-40℃冷置30min。7.2.2.715000r/min离心8min，沉淀溶于50μL超纯水中。7.3DNA含量和纯度的测定
7.3.1紫外区波长扫描
烟叶DNA提取物的产量和纯度用紫外分光光度计波长在220nm～320nm之间扫描测定。7.3.1.1用超纯水将紫外分光光度计调零，校正基线。7.3.1.2将10μLDNA提取液加人比色m中，加超纯水1990μL后，移液器抽打混匀，进行220nm~320nm波长扫描。
7.3.1.3提取的DNA产量以260nm下的吸光值来计算，OD值为1相当于每毫升溶液中含有50μg双链DNA。
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7.3.1.4DNA提取物纯度用OD260/280的值来估算，比值在1.7～1.9为纯度较好，比值大于1.9提取的DNA中含RNA，比值小于1.7提取液中含一些蛋白质等杂质，要重新提取DNA。7.3. 2硝酸还原酶基因序列 PCR 扩增所提取DNA质量可通过对其进行硝酸还原酶基因序列扩增来判定、号「物序列为：NR-1 GTG TCA TGA ACA GAT GGC TCNR-2 GAT TAC TCG TCG AGT GAA GA利用此引物扩增出来的硝酸还原酶基因序列长度为104bp，来确定提取的DNA能否作模板用于检测。
8转基因烟叶检测方法
8. 1共有序列引物的 PCR 检测
8.1.1引物设计
用于转基因烟草检测共有标志主要有：花耶菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌nos终止子序列和编码卡那霉素抗性基因(NPTII),根据这些核甘酸序列设计PCR引物进行烟草转基因检测。8.1.1.135S启动子序列扩增
35S-15'GCTCCTACAAATGCCATCA-335S-25'GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3该引物的扩增片段长度为195bp，作为转基因烟草检测的标志。8.1.1.2nos终止子序列扩增
n0s-15'GATTGAATCCTGTTGCCGGT-3'nos-25'GTAACATAGATGACACCGCG-3'该引物的扩增片段长度为213bp，作为转基因烟草检测的标志。8. 1. 1. 3 NPTII 基因序列扩增NPT-15'GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC-3'NPT-25'GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA-3'该引物的扩增片段长度为411bp，也可作为转基因烟草检测的标志。8.1.2PCR扩增体系
对于35S启动子序列引物35S-1、35S-2和nos终止子引物nos-1、nos-2和NPT-1、NPT-2可采用下列扩增体系进行扩增反应，按下列体系的摩尔数或浓度，根据所作扩增的管数，计算出各组分应加的总体积，在无菌室中加样，再分装至各个0.20mL扩增管中，然后按体系中模板设计的纳克数加人模板，加矿物油离心后放人PCR仪中扩增。表1PCR扩增体系
加样顺序
反应组分
10xbuffer
引物1
引物2
Taq酶
超纯水
DNA模板
总体积
浓度或体积（每个反应管）
220 μmol
25 pmol
25 pmol
37~38μl
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8.1.3PCR扩增条件
对于35S启动子序列引物35S-1、35S-2和nos终止子引物nos-1、nos-2和NPT-1、NPT-2可采用下列循环程序进行扩增：
预变性：95℃下5min；
循环设定：变性94℃，30s；
退火64℃，45s；
延伸72℃,45s；
循环次数：35个循环；
后延伸：72℃5min。
8.1.4电泳及凝胶观察
称琼脂糖溶于0.5×TBE缓冲液中，溶化制成1.5%凝胶，加EB(0.5μg/mL），温度降至45C时倒入放有梳子的凝胶模具中，冷凝后拔出梳子，放入水平电泳槽中，取10uL扩增产物加上样缓冲液（含溴酚蓝指示剂点样，以PCR Marker作为分子量标记进行电泳，紫外分析仪观察电泳结果。8. 2特异性基因序列的 PCR 检测8. 2. 1烟草普通花叶病毒外壳蛋白基因 TMV-CPTMV15'GTGTTCTTGTCATCAGCGTGGGC-3°TMV25'CACCGTTGCGTCGTCTACTCTACG-3'其PCR扩增产物片段长度为202bp8.2.2 黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)CMV15'-ACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAGCG-3'CMV25'-ACATAGCAGAGATGGCGGCAACG-31其PCR扩增产物片段长度为263bp。8.2.3马铃善 Y病毒外壳蛋白基因(PVY-CP)PVY1 5'-GATATTTCAAATACTCGGGCA-3'PVY25'-GCATAACGCGCTAAACCCAC-3其PCR扩增产物片段长度为362bp。8.2. 4烟草菁通花叶病毒复制酶基因(TMV54KD）T54D15'-GAGTTGTCTGGCATCATTGA-3T54D25'-ACAATGGTCAAAGCCGGGTA-3'其PCR扩增产物片段长度为295bp。8.2.5苏云金杆菌杀虫蛋白基因(BT)BT-1 5'CCCACTAGTTAACAATTTGATTGGA-3BT-25'CCGGAAGCTTTAGGACTGTAGGT-31其PCR扩增产物片段长度为299bp。8.3结果验证试验
如果样品的35S启动子和（或）nos终止子序列引物的PCR扩增出现阳性条带，在重新提取DNA，重复前述PCR 检测的同时应进行结果验证试验。8.3.1限制性内切酶酶切反应验证8.3.1.1PCR产物的纯化
将PCR产物移人另一灭菌的1.5mL离心管中，加100μL预冷的无水乙醇，沉淀PCR产物DNA片段，一80℃冷冻1h后，15000r/min离心8min，弃上清，乙醇挥发后加超纯水。654
8.3.1.2酶切反应
8.3.1.2.135S启动子
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对于出现35SPCR阳性反应样品，应通过Asp700(Xmn1）进行限制性内切酶酶切分析，方法是加5u的Asp700到10mL经纯化的PCR产物中，在37℃恒温水浴中培养3h，再进行1.2%琼脂糖电泳和紫外分析，如其195bp片段可被酶切戒115bp和80bp，则可确定为35S特异性扩增产物。8.3.1.2.2nos 终止子
对于呈nos引物PCR阳性反应的样品，利用限制性内切酶Nsil可将180bp的片段切成96bp和84bp的两条片段，方法与35S的酶切反应相同。8.3.2巢式或半巢式PCR反应验证对于PCR扩增片段亮度很弱或未出现的样品，应采用巢式或半巢式PCR方法设计引物对扩增产物进行第二次 PCR反应，以提高检测的灵敏度。巢式或半巢式PCR方法中，第二次扩增是以第一次扩增的产物为模板，引物的设计是根据第一一次扩增产物目标基因序列,使第二次扩增范围在第一次扩增片段范围内。8.3.2.135S 巢式 PCR
35S巢式PCR扩增产物片段长度为110bp。35S-nt-15'CGTTCACCCTAACTACACTAT-335S-nt-25'GTGACTGCCGTCTCCGTAGA-3'8.3.2.235S 半巢式 PCR
在35S半巢式PCR反应中第二次PCR中的一个引物与第一次PCR相同,另一引物位于第一次扩增片段内部，其扩增产物片段长度为134bp。35S-sn-15'ACAGTGGTCCCAAAGATGGA-3'35S-sn-25'GATAGTTGGGATTGTGCGTCA-3'8. 3. 2. 3 nos 终止子巢式 PCR以第一次扩增产物为模板，利用下面一对引物进行第二次扩增，扩增片段长度为104bp。nos-NT-15'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3nos-NT-25'CCCATCTCATAAATAACGTC-3'8.3.3探针杂交验证
探针杂交是特定序列已标记的单链DNA（探针）与另一个固定了的具有互补序列的DNA形成碱基配对，通过放射性自显影或化学发光方法，检测特定DNA序列的存在，试验操作如下；8.3.3.1探针标记：用切口平移化学荧光素标记和检测试剂盒制备碱性磷酸酶标记探针，荧光标记DNA 探针(H-35S-a1)序列为 5'-F1-GGGTCTTGCGAAGGATAGTG-3。8.3.3.2DNA片段转移：用毛细管法或真空转移法将DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
8.3.3.3探针杂交：用2×SSC润湿固定DNA的膜，加预杂交液20mL/100cm，在杂交温度50C下1h，以2.5mL/100cm膜杂交液代替预杂交液50℃C下4h，去除杂交液，用0.2×SSC/0.1%SDS洗两次，每次5min，然后在50C下用0.2×SSC/0.1%SDS洗20min。8.3.3.4DNA探针的检测：用Saran保鲜膜将湿润的膜包好，室温下放置过夜，尽量除去气泡，在用Vinyl覆盖的压片夹中，用MPX光片，室温下曝光4min～6min。8.3.4扩增产物的测序验证
利用扩增片段可包含目的基因的引物组35S1,nos2进行扩增，将片段长度大于1KB的条带回收，纯化并测序，确定所转基因的种类。655
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8.4转基因检测标准与定量PCR
8.4.1转基因检测定性标准
通过对30个标签样品（其中20个是含量为0.1%和0.5%的阳性样品，其余为阴性）的盲检，测出阳性和阴性检出率均为100%，证明利用本方法可以准确地检测含量在0.1%以上的阳性样品；而不致发生假阳性和阴性反应。确定0.1%为转基因检测阳性的定性标准，凡出现PCR特异条带亮度等于或高于0.1%参比对照亮度的样品，则确定为阳性条带，若弱于该亮度，则需重新提取IDNA重复检测。8.4.2转基因定量检测
8.4.2.1外标定量检测法
8.4.2.1.1标准样品制备
利用100%阳性和阴性材料制成已知含量的阳性样品（5%、2%、1%、0.5%和0.1%）。8.4.2.1.2PCR检测
提取待测样、阳性标准样品的DNA，按DNA模板量300ng，待测样品与标准样品在同-体系、同一扩增条件的同一次进行扩增，对比扩增后待测样品与标准物梯度电泳条带的亮度，确定待测样品阳性成分含量。
8.4.2.2内标定量检测法
8.4.2.2.1标准模板的制备
以转基因烟草为材料，通过重叠延伸扩增法制备插入20bp片段的35S启动子和nos终止子的竞争性模板。
8. 4.2.2.2 PCR 扩增
在PCR体系中按模板量500ng，通过预备试验确定与含阳性模板10%、5%、1%、0.5%和0.1%竞争PCR条带亮度相当的标准模板的拷贝数量，按此标准模板的量在反应液加人待测DNA的同时加人标准DNA模板，对比目标片段和各标准片段的亮度，确定待测样品中阳性含量。8.4.2.3实时PCR定量法
利用Taqman定量PCR测定仪（如ABIPRISM7700或Lightcycler）进行实时PCR定量测定。656
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