本标准规定了实验动物配合饲料中维生素的的定方法。即配合饲料中维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、烟酸、维生素B6、总抗坏血素、总胆碱、叶酸、维生素B12、维生素K3、泛酸、生物素、维生素D3的测定方法。本标准适用于试验动物小鼠、大鼠、兔、豚鼠、地鼠、犬和猴的配合饲料及其原料的测定。 GB/T 14924.11-2001 实验动物 配合饲料维生素的测定 GB/T14924.11-2001 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T14924.11—2001
本标准的全部技术内容为推荐性的。前
全价营养饲料》中分离出来，形成独立的标推。本标准从GB14924--1994《实验动物本标准中所列两种方法具有同等效力。本标准及其配套标准自实施之日起，代替GB14924—1994。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位：中国实验动物学会本标准主要起草人：周瑞华、王竹、石磊、王光亚、张瑜、郑陶、刘秀梅。本标准由国家科学技术部委托技术归口单位中国实验动物学会负责解释。本标准于1994年1月首次发布。
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1范围
中华人民共和国国家标准
实验动物配合饲料
维生素的测定
Laboratory animals-Formula feeds-Determination of vitamins
GB/T 14924.11--2001
代替GB149241994
本标准规定了实验动物配合饲料中维生素的测定方法，即配合饲料中维生素A、维生素E、维生素B,、维生素B2、烟酸、维生素B6、总抗坏血酸、总胆碱、叶酸、维生素B12、维生素K3、泛酸、生物素、维生素D：的测定方法。
本标准适用于实验动物小鼠、大鼠、兔、豚鼠、地鼠、犬和猴的配合饲料及其原料的测定。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准时的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。GB/T12388—1990食物中维生素A和维生素E的测定方法GB/T 12390-1990
GB/T 12391---1990
GB/T 12392—1990
GB/T 12395—1990
GB/T 14700--1993
GB/T 14701—1993
GB/T 17407-
GB/T 17812—1999
GB/T 17816—1999
GB/T 17817—1999
GB/T 17818--1999
3测定方法
食物中硫胺素（维生素B,)的测定方法食物中核黄素的测定方法
蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法荧光法和2，4-二硝基苯胺法食物中烟酸的测定方法
饲料中维生素B,测定方法
饲料中维生素B2测定方法
食物中维生素B。的测定
饲料中维生素E的测定高效液相色谱法饲料中总抗坏血酸的测定邻苯二胺荧光法饲料中维生素A的测定高效液相色谱法饲料中维生素D：的测定高效液相色谱法3.1配合饲料中维生素A和维生素E的测定按GB/T12388、GB/T17812、GB/T17817的规定执行。3.2配合饲料中维生素B,的测定
按GB/T14700、GB/T12390的规定执行。3.3配合饲料中维生素B2的测定
按GB/T12391、GB/T14701的规定执行。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-08-29批准下减造罗网
2002-05-01实施
3.4配含饲料中烟酸的测定
按GB/T12395规定执行。
3.5配含饲料中维生素B.的测定
按GB/T17407规定执行。
3.6配合饲料中总抗坏血酸的测定GB/T 14924.11
按GB/T12392、GB/T17816规定执行。3.7配含饲料中总胆碱的测定
3.7.1原理
配合饲料中的胆碱经过碱处理提取后，通过硅镁吸附剂柱色谱纯化，然后用雷纳克盐（reineckate）朋碱反应生成粉红色的胆碱-雷纳克盐复合物。此复合物被内酮洗脱后，在526nm有最大吸收、其吸收值与朋碱浓度成正比。本方法检出限为0.1mg。3.7.2试剂
所有试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。3.7.2.1甲醇。
3.7.2.2三氯甲烷。
乙酸甲酯。
3.7.2.4芮酮。
3.7.2.510%丙酮：取10ml.丙酮与90ml，水混合。3.7.2.6
冰乙酸。
冰乙酸-甲醇溶液：取10ml.冰乙酸和90ml.甲醇混合。3.7.2.8
氢氧化钡。
3.7.2.9硅镁吸附剂（Florisil）：60~100目。3.7.2.10提取液：于100ml甲醇中加人4～5g无水氢氧化钡，搅拌10min再加人10ml=氯甲烷混合，过滤去除多余的氢氧化钡。3.7.2.11雷纳克铵盐（ammoniumreineckate）饱和溶液：称取2~3g雷纳克铵盐，加人100ml.水，搅拌10 min，过滤去除多余的雷纳克铵盐。实验当日配制。3.7.2.12胆碱标准贮备液（5mg/mL)：准确称取无水氯化胆碱0.5761g，溶解于水中，并定容至100ml。冰箱保存。
3.7.2.13胆碱标准应用液（1.0mg/mL）：准确吸取20.0ml.标准贮备液，用水稀释并定容至100)ml.。3.7.3仪器与设备
3.7.3.1实验室常用设备。
3.7.3.2回流提取装置。
3.7.3.3色谱柱：0.8cm（内径）×30cm的玻璃柱，柱上端为容积30～50mL的储液杯，底端收缩变细，并装有活塞。活塞上约1cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm。使用前需干燥。3.7.3.4分光光度计。
3.7.4测定步骤
3.7.4.1提取
称取适量样品（约含5～50mg胆碱），置于100ml具塞锥型瓶中，加人40mL提取液，于76～82C恒温水浴回流3h，回流速度为每秒1～2滴。冷却，样品过滤至100mL容量瓶中，反复用5～10mI.冰乙酸-甲醇溶液洗涤锥形瓶和滤渣，洗液并人容量瓶中，用冰乙酸调节pH至2～6,用甲醇定容至刻度。
3.7.4.2纯化
3.7.4.2.1填装色谱柱：将干燥的硅镁吸附剂约4g浸入甲醇中，取于燥色谱柱，湿法将硅镁吸附剂填还湾要欧
还代行瓷免带
GB/T14924.11--2001
充人色谱柱中，至硅镁吸附剂的高度达10cm左右。用甲醇冲洗色谱柱.并保持甲醇液面高于硅镁吸附剂1~～2cm，直至使用为止。
3.7.4.2.2柱色谱纯化：吸取50ml.的提取液，加到已填装好的色谱柱中，打开底端活塞，使提取液靠重力作用流过色谱柱。立即依次用5,10mL甲醇，2份10mL乙酸甲酯和10mL10%丙酮洗涤色谱柱。接着加人5mL雷纳克铵盐饱和溶液通过色谱柱，用2份10ml.冰乙酸洗涤，直至流出液清亮为止。用15ml.丙酮洗脱色谱柱上胆碱-雷纳克盐复合物的粉红色色谱带，用25mL具塞量筒收集全部洗脱液，并用丙酮定容至15 mL。
3.7.4.3比色测定：用分光光度计，于526nm波长下，以芮酮调节零点，测定样品吸光度值，在标准工作曲线上查出胆碱含量，或用回归方程计算出相应的胆碱含量，求得计算结果。3.7.4.4标准工作曲线：分别吸取0.50,1.0，2.0,3.0,4.0,5.0mL标准应用液，相当于胆碱含量0.5，1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg，按照上述样品测定步骤操作。以胆碱含量做横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准工作曲线，并计算回归方程。3.7.5计算结果
见式(1)。
m××100
式中：X.-—样品中胆碱的含量，mg/100gc—从标准回归曲线上查得的胆碱含量，mg；V,—样品提取液定容体积，mL，V2\——--纯化用提取液的体积,mL;m样品质量，g。
3.7.6结果的允许差
同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值≤10%。3.8配合饲料中叶酸的测定一一微生物法3.8.1原理
叶酸是干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei,L.C，ATCC7469)生长所必需的营养素。在一-定条件下，I.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖强度用测定吸光度值表示。与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。本方法检出限为0.1ng。3.8.2试剂
本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度除特别注明外均为分析纯。3.8.2.1甲苯。
3.8.2.2生理盐水：使用前需灭菌处理。3.8.2.3菌种：千酪乳酸杆菌（(Lactobacillus casei，L.C,ATCC7469)）3.8.2.4磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH6.8)：称取4.35g磷酸钠（NasPO。12H,0），10.39g磷酸氢二钠(Naz2HPO。·7HzO)溶解于800mL水中。临用前加人约5g抗坏血酸，并调节pH至6.8。3.8.2.5鸡胰酶：称取100mg干燥的鸡胰酶，加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，3000r/min离心10min，取上清液备用，临用前配制。3.8.2.6蛋白酶-淀粉酶：分别称取蛋白酶和淀粉酶各200mg，加人20ml.磷酸缓冲液制成勾浆，3000r/min离心10min，，取上清液备用。临用前配制。3.8.2.7氢氧化钠溶液（0.01mol/L）：用20%乙醇配制。3.8.2.8氢氧化钠溶液（10mol/L）。3.8.2.9叶酸标准储备液（200μg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品，用0.01mol/l氢氧化钠溶液溶解并定容至11。储存于棕色瓶中。17
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GB/T 14924.11 --2001
3.8.2.10叶酸标准中间液（200ng/mL）：吸取1.0mL叶酸标准储备液，用0.01mol/.氢氧化钠溶液溶解开定容至11.。储存于棕色瓶中。3.8.2.11叶酸标准应用液（0.2ng/mL）：吸取1.0ml.叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至11。
3.8.2.12酶解酪蛋白：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加人60g去维生素酪蛋白，用10mo1/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0。加人300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶充分混勾。再加人2.5ml甲苯，置37C恒温箱酶解48～72h。将酪蛋白从恒温箱中取出，经121C高压30min以终止反应，去除甲苯。冷却，加10g硅藻土（技术级）搅拌，用布氏漏斗过滤。滤液中加人约60mL冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加至滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复三次。每次过滤时，布氏漏斗内加10g硅藻土助滤。最后滤液用水稀释至1200mL，冰箱保存。取小份酶解酪蛋白液进行干燥处理，如固体含量小于40mg/mL，则需重新制备。
3.8.2.13黄嘌岭溶液：取0.4g黄嘌呤，加人10mL氨水，加热溶解，用水稀释至100mL。冰箱保存。3.8.2.14腺嘌呤-嘌呤-尿嘧啶溶液：分别称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加人（1+4）盐酸溶液，加热溶解，用水稀释至100mI室温贮存。3.8.2.15乙酸缓冲液（1.7mol/L，pH4.5）：38.65g乙酸钠，19.8mL乙酸，加水至500mL。3.8.2.16维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40mL乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素，2.5mg碳酸氢钠，20mg对氨基苯甲酸，40mg盐酸吡多醇，4mg盐酸硫胺素，8mg泛酸钙，8mg尼克酸溶解于50mL水中。将上述两种溶液混合，加水至100ml。3.8.2.17吐温-80溶液：将2g吐温-80加人100mL45C水中，混勾。3.8.2.18还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水溶解至100mL。3.8.2.19甲盐溶液称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100mL，液面上加入少许甲苯以保存之。
3.8.2.20乙盐溶液：称取2g硫酸镁，0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰，加水溶解至100mL，液面上加少许甲苯以保存之。
3.8.2.21基础培养基：酶解酪蛋白100mL，腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液2.5mL，黄嘌呤溶液2.5mL，维生素溶液5mL，吐温-80溶液2.5mL，L-天冬氨酸0.3g，L-盐酸半胱氨酸0.2g，还原型谷胱甘肽溶液2.5ml，葡萄糖20g，乙酸钠20g，甲盐溶液2.5mL，加水至250mL，搅拌，用氢氧化钠溶液调节pH至6.8士0.1，然后加人乙盐溶液2.5mL，磷酸缓冲液200mL，用水补至500mL。冰箱内可保存一周。3.8.2.22琼脂培养基：葡葡糖1g，蛋白陈0.8g，酵母提取物干粉0.2g，乙酸钠（NaAc·3H20）1.7g，甲盐溶液0.2mL，乙盐溶液0.2ml，琼脂1.2g加水至100mL，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH至6.8士0.1。尽快倒人试管中，每管3～5ml塞上棉塞，121C高压灭菌15min，取出后直立试管，冷却至室温，于冰箱内保存。
3.8.3仪器与设备
3.8.3.1实验室常用设备。
3.8.3.2恒温培养箱。
3.8.3.3离心机。
3.8.3.4高压消毒锅。
3.8.3.5震荡器。
3.8.3.6接种针和接种环。
3.8.3.7分光光度计。
3.8.4菌种制备与保存
3.8.4.1储备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。（37士0.5）C恒温培养箱中培养16～24 h。贮于冰箱内，每周转种一次留作储备菌种。518
GB/T14924.11 ----2001
3.8.4.2种子培养液的制备：取2mL叶酸标准应用液和10ml.基础培养基，混匀，分装至4支5ml.离心管中，塞上棉寒、121C高压灭菌15 min，备用3.8.5测定步骤（所有操作均需避光进行）3.8.5.1接种液的制备：使用前天，将菌种街储备菌种管中转种至2支己灭菌的种子培养液中，（37±0.5）（恒温培养箱中培养16～24h。次日晨·混悬种子培养液，无菌操作下吸取0.2ml，将细菌转种至另2支灭菌的种子培养液中，（37士0.5）C再培养6h。取出3000r/min，离心10min，倾去上清液，用已灭菌的生理盐水清洗二次，离心，奔去上清液。最后加5mL生理盐水，震荡混勾，制成菌种混慰液。立即使用。
3.8.5.2样品制备
3.8.5.2.1样品处理：将样品磨成粉末。3.8.5.2.2水解：称取0.1~~0.5g样品（约含叶酸100～300ng）于100mL锥形瓶中，加人50mL磷酸缓冲液，混匀。121（高压水解15min。3.8.5.2.3酶解：水解样品冷却后，加人1ml.鸡胰酶，lml蛋白酶-淀粉酶，1mL甲苯，充分混合（37+0.5）（恒温培养箱中酶解1620h。取出酶解样品用水定容至100mL，过滤。取2mL滤液稀释至20nml.，使叶酸终含量在0.1~0.3ng/ml.范围之内。同时另取支试管，加人1mlL鸡胰酶，lml.蛋白酶-淀粉酶，作酶空白对照。
3.8.5.3标准系列管的制备
取2组平行试管，每管分别加人叶酸标推应用液0.0,0.5.1.0，2.0,3.0，4.0，5.0mL，相当于叶酸含量0.0.1.0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ng，加水补至5.0ml，再加5mL基础培养基，混匀。3.8.5.4样品管的制备
取4组试篇，每管分别加人酶解样品1.0.2.0，3.0.4.0ml，补充水至体积为5.0ml.，再加5ml.基础培养基，混勾。
3.8.5.5灭菌：将以上标准系列管、样品管和酶空自管全部塞上棉塞，121℃高压灭菌15min。3.8.5.6接种：待标准系列管、样品管和酶空白管冷却至室温，在无菌操作条件下接种，每管接种一滴接种液，直接滴在培养基内。留一支标准○管不接种，用于测定吸光度时调零。3.8.5.7培养：置于（37士0.5）C恒温培养箱中培养20~40h。3.8.5.8测定：用分光光度计，波长540nm下，以未接种的标准0管调吸光度值为0.测定标准管、样品管和酶空白的吸光度值。
3.8.5.9绘制标准曲线
以叶酸标准系列含量作横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。3.8.6结果计算
见式(2)。
X = (c- P)XVX10 × 100
m X 1 000
式中：X·-样品中叶酸含量，μg/100g；c---从标准曲线上查得每毫升样品测定管中叶酸含量，ng/mL；p.酶空白对照管中叶酸含量，ng /ml.;V…样品酶解液定容总体积,mL；m样品质量.g;
10---稀释倍数；
100/1000--样品含量由ng/g换算成μg/100g的系数。3.8.7允许误差
间-实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值<10%。(2)
3.9配合饲料中维生素B的测定
3.9.1原理
GB/T14924.112001
维生素Br对于Tuctobucillusleichmannii（ATCC7830）的正常生长是必需的营养素，在定牛长条件下，Luctobucillusleichmuannii的生长繁殖与溶液中维生素Bu的含量成一定的线性关系，用吸光度测定法测定细菌生长繁殖的强度，即可计算出食物及饲料样品中的维生素B含量。本方法最低检出限为0.001 ng.
3.9.2试剂
本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。3.9.2.1甲苯
3.9.2.2柠檬酸（C,H.0,·3H,0)。3.9.2.3磷酸氢钠（Na2HPO),）。3.9.2.4偏重亚硫酸钠（NazS.O,）。3.9.2.5抗坏血酸（生化试剂）。3.9.2.6无水葡萄糖。
3.9.2.7无水乙酸钠。
3.9.2.81胱氨酸（生化试剂）。3.9.2.9I),I-色氨酸（生化试剂）。3.9.2.1010mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中.定容至500ml，。3.9.2.11（1+4）乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml.水充分混勺。3.9.2.12酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500mL烧杯中，加200ml.3mol/l.盐酸，经121（高压水解6h。将水解物转移至蒸发Ⅲ内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml.水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂、用10mol/l.氢氧化钠溶液调节pH至3.5，加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，液面上加少许甲苯于冰箱中保存。（该试剂也可从Dfico公司购得，产品号为No.0288-15-6。）3.9.2.13腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250mL烧杯中、加75mL水和2ml.浓盐酸，然后加热使其完全溶解.冷却。若有沉淀产，加盐酸数滴，再加热，反复至冷却后无沉淀产生为止，用水稀释至100ml。液面上加少许甲苯子冰箱中保存。
3.9.2.14维生素溶液1：称取25mg核黄素25mg盐酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/l乙酸溶液溶解并定容至1000mL。3.9.2.15维生素溶液：将50mg对氨基苯甲酸，25mg泛酸钙.100mg盐酸吡哆醇，100mg盐酸吡哆醛，20mg盐酸吡哆胺，5mg叶酸溶于（1+4)乙醇溶液，并定容至1000mL。3.9.2.16甲盐溶液：称取25g磷酸二氢钾、25g磷酸氢二钾溶于500ml水中，加5滴浓盐酸，混匀。3.9.2.17乙盐溶液：称取10g硫酸镁（MgSO47H,)）、0.5g氯化钠、0.5g硫酸锰（MnS)·4H，）），0.5g硫酸亚铁（FeSO.·7H0)溶于水并定容至500mL，加5滴浓盐酸，混匀。3.9.2.18黄嘌呤溶液：称取1.0g黄嘌呤溶于200mL水中，70C加热条件下，加入30mL氢氧化铵（NH,OH)（2+3），搅拌直至固体全部溶解，冷却后用水定容至1000mL。3.9.2.19天冬酰胺溶液：称取1.0gL-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。3.9.2.20吐温-80溶液：将25g吐温-80溶于乙醇并定容至250mlL。3.9.2.21维生素Bz标准溶液（均使用棕色试剂瓶）。3.9.2.21.1维生素Bi2标准储备溶液（100ng/ml）：称取50μg（精度0.01mg天平）维生:素3.2暗红色针状结晶，用（1+4)的乙醇溶液定容至500mL，4C冰箱储存。3.9.2.21.2维生素Bz标准中间液（1ng/mL）：取2.5ml.储备液用（1+4）的乙醇定容至250ml..4（我传装
冰箱储存。
GB/T 14924. 11 -- 2001
3.9.2.21.3维生素B,2标准应用液（0.02ng/mL）：取1mlL中间液用水定容至50ml.，用时现配。3.9.2.22基本培养基：在本标准的制作中使用了IDifco公司产品，产品号为No.0457-151。也可如下自己配制：
将下列试剂混合于500mL烧杯中，加水至200mL，以溴甲酚紫作外指示剂，用10mol/1.氢氧化钠液调节pH为6.0~6.1.用水稀释至250ml。酸解酪蛋白
腺嘌岭、鸟嘌岭、尿嘧啶溶液
天冬氨酰溶液
叶温-80溶液
甲盐溶液
乙盐溶液
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维生素溶液I
黄嘌吟溶液
抗环血酸
I-胱氨酸
I).L-色氨酸
尤水葡萄糖
无水乙酸钠
3.9.2.23琼脂培养基：在600mL水中，加人15g蛋白陈，5g水溶性酵母提取物十粉，10g无水葡萄糖.2g无水磷酸二氢钾.100mL番茄汁，10mL吐温-80溶液，每500ml液体培养基加5.0～7.5g琼脂，加热溶解，用10mol/L氢氧化钠调节pH为6.5~6.8，然后定容至1000mL，分装于试管中，于121（高压灾菌10min，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱保存。3.9.2.24生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000mI.水中。每次使用时分别倒人2~4支试管中，筹支约加10mL，塞好棉塞，于121C高压灭菌10min，备用。3.9.2.250.4g/l溴甲酚紫指示剂：称取0.1g溴甲酚紫于小研钵内，加1.6ml.0.1mol/l.氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。3.9.3仪器与设备
3.9.3.1实验室常用设备。
3.9.3.2电热恒温培养箱。
3.9.3.3压力蒸汽消毒器。
3.9.3.4液体快速混合器。
3.9.3.5离心机。
3.9.3.6硬质玻璃试管：20mm×150mm。3.9.3.7分光光度计。
3.9.4菌种与培养液的制备与保存3.9.4.1储备菌种的制备：Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）接种于直面琼脂培养管中，在（37土0.5）C恒温箱中培养16～24h，取出后放入冰箱中保存，每隔两周至少传种-次。在实验前天必须传种…次。
3.9.4.2种子培养液的制备：加2mL0.02ng/mL维生素B,z标准工作液和3mL基本培养基于10ml.离心管中，塞好棉塞，于121C高压灭菌10min，取出冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用。3.9.5操作步骤
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GB/T 14924.11--- 2001
3.9.5.1接种液的配制：使用前--天，将已在琼脂管中生长16～~24min的L，leichmannii接种于种子培养液中，在（37士0.5）C培养16～24h，取出以3000r/min离心10min，弃去上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加人3mL灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入已灭菌的注射器中，供接种用。3.9.5.2样品制备
3.9.5.2.1水解液的制备：称取1.3g无水磷酸二氢钠、1.2g柠檬酸及0.1g偏重亚硫酸钠（NasS0),）溶于水中并定容至100mL，用时现配。3.9.5.2.2称取适量样品，置于100mL三角瓶中，加70ml水解液，混匀，于121C高压灭菌10min。取出冷却至室温，过滤。以溴甲酚紫为外指示剂,用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0～6.1,将水解液移至100ml.容量瓶中，用水定容至刻度。样品需进行适当稀释，使测定管中NazS20s终浓度应.0. 03mg/ml.。
3.9.5.3样品试管的制备
每组平行样品管中分别加人1.0,2.0，3.0,4.0ml样品水解液，并用水稀释至5mL，然后再加入5ml.基本液体培养基。
3.9.5.4标准系列管的制备
每组试管中分别加入维生素B2标准工作液0.0.1.0,2.0,3.0.4.0，5.0ml.使每组试管中维生素B1的含量为0.00ng.0.02ng.0.04ng,0.06ng，0.08ng，0.1rg，加水至5ml.再加人5mL基本液体培养基，需做三组标准曲线。
3.9.5.5灭菌：样品管与标准管均用棉塞塞好，于121C高压灭菌10min。接种与培养：待试管冷至室温后，每管接种一滴种子菌液，于（37土0.5）C恒温箱中培养16~20h。3.9.5.6测定吸光度：于640nm波长条件下，以标准系列中的零管调节仪器零点，测定样品管液体及标准管培养物的吸光度值。
3.9.6计算
以维生素B,2标准系列的ng数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。由样品测定管中的吸光度值在曲线上查出相对应的样品测定管中的维生素B12含量，再按以式（3)计算样品中维生素Bi2含：
6×100
m × 1 000
式中：X样品中维生素B?含量，μg/100g；-测定管中的维生素B12含量，ng/mL；样品水解液的定容体积，mL.；
厂.样品液的稀释倍数；
样品质量g。
3.9.7结果的重复性
同一实验室重复测定或同时测定两次结果的相对偏差绝对值≤10%。3.10配合饲料中维生素K（甲醒）的测定3.10.1原理
在氨存在的条件下维生素K（甲萘醒，Vk）与氰乙酸乙酯形成蓝紫色的有色物质，在575nm下的吸光度值与维生素K；的浓度成正比，用分光光度计测定有色物质的吸光度值，由标准曲线计算样品中维生素K，的含量。本方法检出限为0.05mg。3.10.2试剂
本实验所用试剂均为分析级，实验用水为蒸馏水。3.10.2.10.1mol/L碘溶液：称取25g碘化钾溶解于20ml.水中，加9.8g碘试剂.混匀溶解，加水全75ml。则存于棕色瓶中，避光保存24h。GB/T 14924.11
3.10.2.20.1mo1/L硫代硫酸钠（NazS)）：将水煮沸后冷却。称取25g硫代硫酸钠（Na.S.()5H))溶解于500ml.含0.1g碳酸钠的冷却水中、并用冷却的水稀释至1000)ml.，3.10.2.3淀粉指示剂：称取2g可溶性淀粉.加于10mL水中，摇勾。然后缓慢加至200ml.沸水中，煮2 min。
3.10.2.4氨水-异内醇溶液：取异丙醇与等体积的浓氨水混合。3.10.2.5氰乙酸乙酯（30g/L）：取3g氰乙酸乙酯溶解于100ml异内醇中。3.10.2.6Vk标准溶液（0.1mg/mL）准确称取50mgVk标准品，移至500ml.棕色容量瓶中.用异丙醇溶解并定容至刻度。
3.10.3仪器与设备
3.10.3.1实验室常用设备。
3.10.3.2分光光度计。
3.10.4测定步骤（所有操作均需避光进行）3.10.4.1提取
准确称取约15g已混匀的样品，准确加入100mL水，搅拌10min，保证Vk，充分溶解与混勾。过滤·如滤液浑浊，则反复过滤至澄清。3.10.4.2氧化去杂质：吸取40mL滤液至100ml容量瓶中，加1～2滴淀粉指示剂，用0.1mol/1.碘溶液滴定，至出现持续的蓝色。向溶液中滴入1滴0.1mol/LNa2S.0消除蓝色。用水定容至刻度。3.10.4.3标准管和样品管的制备：分别取2套20mL比色管，分别按表1顺序加人V标准溶液、样品提取液及试剂，制备标准管和样品管。表1标准管和样品管的制备
Vk标准溶液,mL
样品提取液，mL
异丙醇,mL
乙基氰乙酸,mL
氨水-异丙醇,mL
标准管
空白管
样品管
测定管
各管用水定容至20mL，摇勾，放置20min。3.10.4.4比色测定：用分光光度计于575cm波长下，以标准0管调仪器零点，测定各管吸光度值。3.10.5计算：以标准Vz，含量作横坐标，吸光度值作纵坐标，并绘制标准曲线，计算回归方程。用样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上查出样品管的Vk,含量、然后计算出样品中Vk。的含量，见式（4）。
X = × 25 × 100
式中：X---m-样品中Vk的含量，mg/100g；Ca—样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上对应的V,含量，mg；m--样品质量·g,
25-样品稀释倍数。
3.10.6结果的允许差
同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值<10%。3.11配合饲料中泛酸的测定
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（4）
3.11.1原理
GB/T14924.11--2001
泛酸对于Luctobucilluspluntarum（ATCC8014）的正常生长是必需的营养素，在一定生长条件下，Lactobucillusplantarum的生长繁殖速度与溶液中泛酸的含量成一定的线性关系，细菌增殖的强度可用比浊法或光密度法测定，与标准曲线比较，可计算出样品中的泛酸含量。本方法最低检出限为5ng。3.11.2试剂
本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。3.11.2.1甲苯，
3.11.2.21mol/L盐酸溶液。
3.11.2.3Tris缓冲溶液：将24.2g三羟基氨基甲烷溶于150ml.水中，用7.5mol/l.氢氧化钠溶液调pH为8.0～8.3然后定容至200ml，贮存于4C冰箱中，保质期为2周。3.11.2.47.5mol/L氢氧化钠溶液：溶150g氢氧化钠于水中，定容至500mL。3.11.2.50.2mol/l.乙酸：12ml.冰乙酸用水定容至1000mL。3.11.2.60.2mol/L乙酸钠溶液：将16.4g乙酸钠溶于水中并定容至1000ml.。3.11.2.70.1mol/L碳酸氢钠溶液：称取0.85g碳酸氢钠溶于水中，然后定容至100ml.。3.11.2.80.2mol/L碳酸氢钾溶液：称取10.012g碳酸氢钾溶于水中，然后定容至500ml。3.11.2.920g/l.碱性磷酸酶溶液：称取2g碱性磷酸酶（Sigma公司No.P-3877)溶于水中，然后定容至100ml。贮存于4C冰箱中保存。3.11.2.1010%鸽子肝脏提取物溶液：将所用容器在配制此试剂前一天放入4C箱中过夜。（1）称取30g鸽子肝脏丙酮提取物粉末（Sigma公司No.I.-8376)放人冷的研钵中，分两次加人300ml0.2mol/1.碳酸氢钾，置于0C的冰浴中研磨成悬浊液；（2)将此悬浊液分别放人8支离心管中，塞紧后充分振摇，冷冻10min，然后3000r/min离心5min；（3）将上清液放人500mL冷的烧杯中，加150g离子交换树脂 Dowex]-X8(Bio-Rad LaboratoriesInc.，Brussels,Belgium），放在冰浴中震摇5 min;将混合液倒入离心管中，3000/min离心5min；（4）再将上清液移人另一个冷的500ml，烧杯中，冷冻10min；（5)重复[.述（3）、（4)步骤一次；(6)然后分装于试管中，冷冻条件下保存，用前化冻。3.11.2.11酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500mL烧杯中，加200ml3mol/L盐酸，于121C高压水解6h。将水解物转移至蒸发Ⅲ内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200mL水使之溶解后再蒸发至离状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/l.氢氧化钠调节pH至3.5。加2）g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。3.11.2.12胱氨酸、色氨酸溶液：称取4gl-胱氨酸和1gL-色氨酸（或2gDI.-色氨酸）于800mL水中，加热至70～80C，逐滴如入（1十5）盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000ml.，贮存于试剂瓶中，液面上加少许甲苯于冰箱中保存。3.11.2.13腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250mL烧杯中，加75ml水和2mL浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml。液面土加少许承苯于冰箱中保存。
3.11.2.14吐温-80溶液：将25g吐温-80溶于乙醇中并定容至250ml。3.11.2.15维生素溶液1：称取20mg核黄素，10mg盐酸硫胺素，0.04mg生物素，用0.2mo1/l.乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.11.2.16维生素溶液Ⅱ：10mg对氨基苯甲酸.50mg尼克酸，40mg盐酸吡哆醇，溶于（1+3）的乙醇漆液，并定容至1000ml。
3.11.2.17盐溶液A：称取25g磷酸二氢钾和25g磷酸氢二钾溶于500ml.水中，加5滴浓盐酸。3.11.2.18盐溶液B：称取10g硫酸镁（MgSO：·7H0）、1g氯化钾、0.5g硫酸锰（MnS)，·4H.0）2.1
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0.5g硫酸亚铁（FeS)·7H0）、23ml.85%磷酸，溶于水中并定穿至500ml3.11.2.19泛酸标准溶液
3.11.2.19.1泛酸标准储备溶液（40μg/ml.）：称取43.47mgD泛酸钙（Sigma公司.No.P.2250）.溶解于500mL水中、加人10mL0.2mol/L的乙酸，100ml0.2mol/l.乙酸钠，然后用水定容至1000ml..此时溶液的泛酸钙浓度为43.47μg/ml，相当于泛酸浓度为10μg/ml，在冰箱中些存。3.11.2.19.22泛酸标准中间液（1.0μg/mL）：取25ml，储备液放人500ml.水4，再加人10ml0.2 mol/1.的乙酸，100ml0.2mol/L乙酸钠,然后用水庭容至1 000 ml，在冰箱中贮存3.11.2.19.3泛酸标准应用液（10ng/ml）：取1mL中间液用水定容至100mL，在冰箱中贮存。3.11.2.20基本培养基：本标准中使用了Difco公司产品，产品号为No.0816-15-7。也可按下列配方自行配制：
将下列试剂混合于500ml烧杯中，加水至200mL。以溴瞬香草酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠液调节pH至6.8，用水稀释至250mL。酸解酪蛋白
胱氨酸、色氨酸溶液
腺嘌岭、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液
维生素溶液1
维生素溶液1
盐溶液A
盐溶液B
无水葡萄糖
乙酸钠（NaAc·3H,O)
吐温-80溶液
3.11.2.21琼脂培养基：在600mL水中，加人15g蛋白陈，5g水溶性酵母提取物干粉，10g无水葡萄糖.2g无水磷酸二氢钾，100ml番茄汁，10ml.吐温-80，每500mL液体培养基加10～15g琼脂，加热溶解。月7.5mol/l.氢氧化钠调节pH为6.5～6.8，然后定容至1000ml，分装于试管中。于121C高压火菌10 min，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱保存。3.11.2.22生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000ml水中。每次使用时分别倒入2~4支10ml试管中，每支约加10ml.，塞好棉塞，于121C高压灭菌10min，备用。3.11.2.230.4g/1.溴麝香草酚蓝溶液：称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵内，加1.6ml.0.1mol/l.氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。3.11.2.240.4g/l.溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4ml.0.1mol/L氢氧化钠研，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。3.11.2.251g/l.漠酚蓝乙醇溶液：称取0.1g溴酚蓝，用乙醇溶解后，加乙醇稀释至100ml.。3.11.3仪器与设备
3.11.3.1实验室常用设备。
3.11.3.2电热恒温培养箱。
3.11.3.3压力蒸汽消毒器。
3.11.3.4液体快速混合器。
3.11.3.5离心机。
3.11.3.6分光光度计或浊度计。3.11.3.7硬质玻璃试管：20mm×150mm。3.11.4菌种与培养液的制备与保存3.11.4.1储备菌种的制备：Lactobucillusplantarum（ATCC8014)接种于直面琼脂培养管中，在（37325
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