本标准规定了牛奶和奶粉中安乃近代谢物4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氨基安替比林残留量的测定。 GB/T 22971-2008 牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22971-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22971--2008
牛奶和奶粉中安乃近代谢物
残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of metabolite residues of dipyronein milk and milk powder--LC-MS-MS method2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准附录A、附录B为资料性附录。前
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口GB/T22971—2008
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：沈金灿、谢丽琪、肖陈贵、朱玉兰、熊贝贝、林燕奎、庞国芳。1范围
牛奶和奶粉中安乃近代谢物
残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T22971—2008
本标准规定了牛奶和奶粉中安乃近代谢物4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine）、4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminoantipyrine）、4-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine）和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine）的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-氮基安替比林残留量的测定。本标准的方法检出限为：对于牛奶，4-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林均为5.0μg/kg；对于奶粉，4-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林均为40.0μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义GB/T6379.1
(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT）GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-—2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留加入Tris溶液后用乙腈提取，提取液经正已烷脱脂净化，液相色谱-串联质谱仪测定。4-乙酰氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-氨基安替比林采用外标法定量，4-甲基氨基安替比林采用内标法进行定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2异丙醇。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4三羟甲基氨基甲烷(Tris）。4.5乙酸铵：色谱纯。
4.61.0mol/LTris溶液：准确称取12.1g三羟甲基氨基甲烷，用水定容至100mL4.7样品定容溶液：甲醇-水(1+19)。1
GB/T22971—2008
4.85mmol/L乙酸铵溶液：准确称取0.385g乙酸铵，用950mL水溶解，用乙酸将溶液调至pH3.0再加水定容至1000mL
4.94-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine，Ci2HisNO，CAS：519-98-2）、4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminoantipyrine，CiHisN,O2，CAS：83-15-8），4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoanti-pyrineC2HiaNOzCAS：1672-58-8）和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrineCHiaNO,CAS83-07-8）标准物质：纯度≥99%。
4.10内标标准物质：4-异丙基氨基安替比林（4-isopropylantipyrine，Cu4HgN,O)，纯度≥99%。4.11100mg/L标准储备溶液：准确称取适量的各种安乃近代谢物标准物质（4.9），用甲醇（4.1)配制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，避光—18℃保存。4.121.0mg/L混合标推储备溶液：吸取每种适量标准储备溶液（4.11），用甲醇稀释成1.0mg/L的混合标准工作溶液，避光一18℃保存。4.13100mg/L内标储备溶液：准确称取适量的内标标准物质（4.10）用甲醇（4.1）配制成浓度为100mg/L标准储备溶液，避光一18℃保存。4.141.0mg/L内标工作溶液：吸取适量的内标储备溶液（4.13），用甲醇稀释成1.0mg/mL的内标标准工作溶液，避光一18℃保存。4.15基质混合标准工作溶液：吸取适量的混合标准储备溶液（4.12）和适量内标工作溶液（4.14），用空白样品提取液配成浓度为1.0μg/L、5.0μg/L10.0μg/L20.0μg/L40.0μg/L100μg/L和内标浓度为10.0μg/L的基质混合标准工作溶液。当天配制。4.16滤膜：0.2μm
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。5.2旋转蒸发仪。
5.3旋涡混匀器。
5.4分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.5移液器：10μ～100μ和100μ~1000μL5.6带刻度聚丙烯离心管：15mL和50mL，具塞。5.7
低温离心机：转速大于5000r/min，可制冷到4℃5.8容量瓶：25mL。
5.9鸡心瓶。
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混勾，分为两份，置于样品瓶中，密封，并作上标记。6.2试样保存
牛奶置于4℃冰柜中避光保存，奶粉则在室温下置于干燥器保存。7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶
称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL带刻度的聚丙烯离心管（5.6）中，加人100μL内标工作2
GB/T22971—2008
溶液（4.14）和0.5mL1.0mol/L的Tris溶液（4.6），再加人10mL乙，旋涡混合1min，振荡提取15min，4℃下5000r/min离心5min，提取液转移至25mL容量瓶（5.8）中。再加人8mL乙腈，重复上述操作，合并提取液，用乙睛定容至25mL，混匀。7.1.2奶粉
取12.5g奶粉，精确至0.01g，置于100mL烧杯中，加适量35℃~50℃水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总重量为100g，充分混匀后准确称取5g（精确到0.01g）样品于50mL聚丙烯离心管中，按7.1.1步骤进行处理。
7.2净化
取5.0mL提取液至干净的15mL离心管中，加入3.0mL乙腈饱和过的正已烷，旋涡振荡3min，4℃下5000r/min离心5min，弃去正已烷层。将乙腈层转移至鸡心瓶（5.9）中，再加入5.0mL异丙醇，在40℃下旋转蒸发至近干。残渣加入1.0mL样品定容溶液（4.7）溶解，混勾后过滤膜（4.16），供液相色谱-串联质谱测定。7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确至0.01g），按7.1和7.2步骤操作。7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：Cia色谱柱，1.7μm，50mm×2.1mm（内径）或相当者；b)bzxz.net
柱温：40℃；
进样量：10μL；
流动相、流速及梯度洗脱条件见表1表1流动相、流速及梯度洗脱条件时间/min
质谱参考条件
流速/（mL/min）
质谱参考条件如下：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式多反应监测（MRM)；
电喷雾电压：3000V；
碰撞气：氩气；
辅助气流速：750L/h；
辅助气温度：350℃；
离子源温度：105℃；
5mmol/L乙酸铵溶液（pH3.0)/%
参考保留时间、定性离子对、定量离子对、碰撞能量及锥孔电压见表2甲醇/%
GB/T22971—2008
化合物名称
4-甲酰氨基安替比林
4-氨基安替比林
4-甲基氨基安替比林
4-乙酰氨基安替比林
4-异丙氨基安替比林
(内标）
表2安乃近代谢物测定的质谱参数参考保留时间/
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
定性离子对
232/104
232/83
204/159
204/83
218/56
218/97
246/228
246/104
246/56
246/125
定量离子对
232/104
204/159
218/56
246/228
246/56
碰撞能量/
锥孔电压/
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与基质混合标准工作溶液中对应的相对保留时间偏差在土2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许的最大偏差
7.4.3.2定量测定
2010K≤10
在仪器最佳工作条件下，对基质混合标推工作溶液进样，以峰面积或峰面积比值为纵坐标，基质混合工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。四种安乃近代谢物标准物质和内标物的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中的图A.14-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林采用外标法定量；4-甲基氨基安替比林以4-异丙基氨基安替比林作为内标，采用内标法进行定量。本方法对四种安乃近代谢物的添加回收率数据参见附录B中的表B.1和表B.27.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算
4-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林结果按式（1)计算：X=c××1000
Vy1000
式中：
X-——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg)；c一从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL)；4
样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
4-甲基氨基安替比林结果按式(2)计算：Asix
X= Cg×A×cs
式中：
X一试样中被测物残留量，单位为微克每于克（μg/kg）；Cs——基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；A——试样溶液中被测物的色谱峰面积；As—基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；Cs
Asi—基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A——试样溶液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；V
试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
GB/T22971-2008
.（2)
本部分的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限，牛奶和奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度范围及重复性方程见表4表4添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
4-甲酰氨基安替比林
4-氨基安替比林
4-甲基氨基安替比林
4-乙酰氨基安替比林
4-甲酰氨基安替比林
4-氨基安替比林
4-甲基氨基安替比林
4-乙酰氨基安替比林
添加浓度范围
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限r
lgrm0.9814lgm-0.5435
lgr=1.0221lgm-0.6365
lgr=0.8383lgm-0.4033
Igr=1.0333lgm-0.6554
Igr=0.8907lgm-0.296 9
lgr=1.1079lgm-0.8764
lgr=0.8218lgm-0.1982
lgr=1.1130lgm-0.8071
单位为微克每千克
再现性限R
lgR=0.9031lgm-0.5016
lgR=0.9649lgm-0.5252
lgR=0.8449lgm-0,4098
lgR=0.9731lgm-0.5472
lgR=0.9931 lgm-0.515 1
lgR=1.0879lgm-0.7730
lgR=0.9789lgm-0.5250
IgR=1.0793lgm-0.7428
如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，牛奶和奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表45
GB/T22971-—2008
附录A
（资料性附录）
标准物质的多反应监测（MRM)色谱图四种安乃近代谢物标准物质及内标物的多反应监测（MRM)色谱图，见图A，1100%7
204/159
4-氨基安替比林（AA)
239min
218/56
SersAntrer
4-甲基氨基安替比林（MAA）
232/83
4-乙酰氨基安替比林（AAA）
246/228
4-甲酰氨基安替比林（FAA）
246/56
4-异丙氨基安替比林（内标，IS)5.0μg/L安乃近标准物质及内标物的多反应监测（MRM)色谱图图A.1
附录B
（资料性附录）
回收率
GB/T22971-—2008
本方法对于牛奶中4种安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据，见表B.1表B.1牛奶中安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据安乃近代谢物名称
4-甲酰氨基安替比林
4-氨基安替比林
4-甲基氨基安替比林
4-乙酰氨基安替比林
添加浓度/（μg/kg）
平均回收率/%
本方法对于奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据，见表B.2表B.2奶粉中安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据安乃近代谢物名称
4-甲酰氨基安替比林
4-氨基安替比林
4-甲基氨基安替比林
4-乙酰氨基安替比林
添加浓度/（μg/kg）
平均回收率/%
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。