本标准规定了牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定和确证。 GB/T 22988-2008 牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22988-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22988—2008
牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素液相色谱-串联质谱法
残留量的测定
Determination of spiramycin,pirlimycin,oleandomycin,tilmicosinerythromycin and tylosin residues in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22988—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局
本标准主要起草人：郭春海、艾连峰、段文仲、陈瑞春、马育松、窦彩云、刘宝圣、张增利、庞国芳。I
1范围
牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T22988—2008
本标准规定了牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的高效液相色谱-串联质谱测定方法，本标准适用于牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定和确证。
本标准的方法检出限：牛奶为1μg/kg，奶粉为8μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-11994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987MOD）3原理
用乙睛提取试样中的分析物，固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙腈，液相色谱纯。
4.2甲醇，液相色谱纯。
4.3乙酸，液相色谱纯。
4.4甲酸铵，液相色谱纯。
4.5磷酸氢二钠。
4.6氢氧化钠。
4.7甲醇-水溶液（3+7)：300mL甲醇与700mL水混合。4.85mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用水溶解，定容至100mL。4.90.1mol/L磷酸盐缓冲溶液：6g磷酸氢二钠（4.5)溶解于450mL水中，用氢氧化钠（4.8)溶液调节pH=8，加水至500mL，使用前配制。4.100.1mol/L甲酸铵溶液：0.63g甲酸铵（4.4)加水溶解至1000mL。4.11标准品：螺旋霉素（spiramycin，CAS：8025-81-8）、吡利霉素（pirlimycin，CAS：79548-73-5）、竹桃霉素（oleandomycin，CAS：7060-74-4）、替米卡星（tilmicosin，CAS：108050-54-0）、红霉素（erythromycin，GB/T22988—2008
CAS：114-07-8）、泰乐菌素（tylosin，CAS:1401-69-0），纯度均大于等于98%。4.12标准储备液：分别精确称取适量标准品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液。4.13混合标准中间工作液：取标准储备液（4.12)各1mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1μg/mL。4.14滤膜：0.45μm
4.15HLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL磷酸盐缓冲溶液（4.9)预处理。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。5.2离心机：转速大于3000r/min。5.3旋涡混合器。
5.4旋转蒸发仪。
5.5氮吹仪。
5.6固相萃取装置。
6试样的制备与保存
6.1牛奶
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4℃下保存，并标明标记。6.2奶粉
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记。7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶
称取4g，准确至0.01g，牛奶样品于50mL具塞离心管中，加人20mL乙睛振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中。再用10mL乙腈重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。
7.1.2奶粉
称取0.5g，准确至0.01g，奶粉样品，加入4mL水于50mL具塞离心管中，混匀。加入20mL乙腈振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中。再用10mL乙重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。7.2净化
将提取液于45℃下旋转蒸发至约4mL左右，加人2mL磷酸盐缓冲液（4.9），混勾后，转移到已条件化的HLB固相萃取柱（4.15）上，再用2mL磷酸盐缓冲液洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到柱上，以小于2mL/min流速滴下。接着依次用3mL水和2mL甲醇-水溶液（4.7）淋洗并抽干柱，最后用6mL乙腈洗脱并收集于10mL带刻度的玻璃管中（此过程流速小于2mL/min）。洗脱液在45℃水浴上氮气吹至约1mL，用甲酸胺溶液（4.10）定容至2mL，涡旋混合后，过0.45μm滤膜供HPLC-MS-MS分析。
7.3空白基质溶液的制备
将取牛奶阴性样品4g，奶粉阴性样品0.5g，精确到0.01g，按7.1和7.2操作。1）HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：苯基柱，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；色谱柱温度：30℃；
进样量：15μL；
流动相梯度及流速见表1。
时间/min
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
液相色谱梯度洗脱条件
流速/(μL/min）
离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI十）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM)；鞘气压力：104kPa；
辅助气压力：138kPa；
正离子模式电喷雾电压（IS)：4000V；毛细管温度：350℃；
源内诱导解离电压：10V；
Q1为0.7,Q3为0.7；
碰撞气：高纯氩气；
碰撞气压力：0.2Pa；
0.1%甲酸水溶液/%
参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2。表2参考保留时间、监测离子对和裂解能量化合物名称
螺旋霉素
吡利霉素
竹桃霉素
替米卡星
红霉素
泰乐菌素
保留时间/min
监测离子对(m/2)
843.50/173.87
843.50/540.09
411.12/111.985
411.12/363.02
688.46/158.20
688.46/544.30
869.57/173.83°
869.57/155.89
734.18/157.88*
734.18/576.13
916.36/173.80*
916.36/772.18
GB/T22988—2008
甲醇/%
裂解能量/eV
为定量离子对，对于不同质谐仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳3
GB/T22988—2008
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.3.2定量测定
2010K≤10
在仪器最佳工作条件下，对混合基质标准校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，混合基质校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标准物质多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。
7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6回收率试验
吸取适量混合标准工作溶液，用空白基质溶液稀释成所需浓度的标准校准溶液。阴性样品中添加标准溶液，按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率，回收率范围参见附录B中的表B.1。7.7空白试验
除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算
试样中分析物的残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：100
式中：
X，一试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；C;—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL)；m样品溶液所代表最终试样的量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
（1）
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限（r），被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4和表5。
化合物名称
螺旋霉素
吡利霉素
竹桃霉素
替米卡星
红霉素
泰乐菌素
GB/T22988—2008
4牛奶中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克表4
添加浓度范围
注：m为两次测定值的算术平均值。表5
化合物名称
螺旋霉素
吡利霉素
竹桃霉素
替米卡星
红霉素
泰乐菌素
重复性限
lgrm1.1344lgm-0.8765
r=0.1762m-0.0356
Igr=0.9909lgm-0.812 1
r=0.135m+0.0002
lg r=0. 829 4 lgm-0. 914 4
lgr=1.1755lgm0.8883
再现性限R
lgR=0.8221lgm-0,4995
R=0.2104m+0.1712
IgR=1.101 0 lgm-0.551 9
R=0.4061m-0.3118
lgR=0.8442lgm-0.6306
lgR=0.9544lgm-0.5613
奶粉中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克添加浓度范围
注：m为两次测定值的算术平均值。重复性限，
lgr=0.9740lgm0.6973
r=0.1811m-0.0675
r=0.1387m+0.2924
r=0.1374m+0.2364
lgr=0.8404lgm-0.6594
lgr=1.0699lgm-0.8131
再现性限R
lgR=0.8565lgm-0.4092
R=0.2055m+1.1866
R=0.3701m-1.4134
R=0.3727m-2.1249
lgR=0.8448lgm-0.5026
lgR=0.9585lgm0.5348
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限（R），被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4和表5。
GB/T22988—2008
附录A
（资料性附录）
标准物质多反应监测（MRM）色谱图螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素标准物质多反应监测（MRM）色谱图，见图A.1。
RT:0.00-10.50
螺旋毒素
843.50/173.87
螺旋莓素
843.50/540.09
吡利莓素
411.12/111.98
吡利莓素
411.12/363.02
竹桃霉素
688.46/158.20
竹桃每素
688.46/544.30
RT:0.00-10.50
替米卡星
869.57/173.83
替米卡星
869.57/155.89
红莓霉素
734.18/157.88
红莓素
734.18/576.13
泰乐菌素
916.36/173.80
泰乐菌素
916.36/772.18
图A.1标准物质多反应监测（MRM)色谱图10
附录B
（资料性附录）
回收率
六种化合物的添加浓度及其平均回收率范围数据，见表B.1。表B.1六种化合物的添加浓度及其平均回收率范围数据化合物名称
螺旋霉素
吡利霉素
竹桃霖素
替米卡星
红霉素
泰乐菌素www.bzxz.net
添加浓度/（μg/kg）
平均回收率范围/%
78.0~87.0
78.0~95.0
82.2~97.2
77.0~97.0
73.0~94.5
78.3~92.0
75.0~93.5
82.2~98.0
74.5~96.0
72.5~94.5
77.6~96.6
72.4~93.6
74.0~95.0
81.5~96.5
79.4~91.1
77.0~88.0
76.0~89.0
79.2~95.0
74.0~92.6
GB/T22988—2008
添加浓度/（μg/kg)
平均回收率范围/%
79.1~98.0
79.4~98.1
77.8~96.6
70.0~94.4
68.3~92.0
78.4~94.5
74.8~98.1
80.3~99.8
81.3~98.1
73.4~89.4
85.0~94.4
78.1~96.9
78.6~98.5
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