本标准规定了固定化葡萄糖异构酶制剂的术语和定义、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存及保质期。本标准适用于经淀粉质(或糖质)为原料，经微生物发酵、提纯、固定化制得的固定化葡萄糖异构酶制剂产品的生产、检验和销售。 GB/T 23533-2009 固定化葡萄糖异构酶制剂 GB/T23533-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67. 220. 20
中华人民共和国国家标准
GB/T23533—2009
固定化葡萄糖异构酶制剂
Immobilized glucose isomerase preparations2009-04-27 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-11-01实施
本标的附录 A 为资料性附录。
本标准由中国轻工业联合会提出前
本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会归口。GB/T23533—2009
本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、诺维信（中国)生物技术有限公司。木标推主起草人：张蔚、腾智津、郭新光、唐辰、翟文景。http://foodmate.net1范围
固定化葡萄糖异构酶制剂
GB/T 23533—2009
本标准规定「固定化葡葡糖异构酶制剂的术语和定义、要求、试验方法检验规则和标志，包装、运翰，存及保质期。
本标准适用于经淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯、固定化制得的固定化葡萄糖异构酶制剂产品的生产、检验和销售。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注月期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标推。GB/T191包装储运图示标志(GB/T191：2008,IS0780:1997,M0D)3术语和定义
下列术语和定义适用于本标。
葡萄糖异构酶glucoseisomcrase能将D-葡萄糖转化为D-果糖的酶，3.2
固定化葡萄糖异构酶immobilized glucoseisomerase经载体固定化而成的葡萄糖异构酶。3.3
葡萄糖异构酶活力activityofglucoseisomerase葡萄糖异构活力以葡葡糖异构活力单位表示，定义为1名固体化葡萄糖异构酶，在本标准规定的反应条件下，1h转化产生1mg果糖，即为1个酶活力单位，以u/g表示。3.4
生产能力productivity
在适宜的工作条件下，酶活力降至原活力的10%的过程中，1k固定化悔能转化绝干葡萄糖为绝干果葡糖的量。
4要求
4.1外观
不结块，无异味，
4.2固定化载体
所使用的固定化载体需符合相关标推要求。4. 3理化要求
应符合表1的规定。
GB/T23533-—2009
酶活力\/(u/g)
生产能力/(t/kg）
下燥失重/%
表1固定化葡萄糖异构酶制剂的理化要求目
可按供需双方合同规定的酶活力规格执行。4. 4卫生要求
应符合国家有关规定。
5试验方法
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.1外观
称墩样品10g(或10ml.),观察、嘎闻作出判断，做好记录。5.2酶活力
5. 2. 1 适用于链霉菌(Streptomyces sp. )生产的葡萄糖异构酶制剂5.2.1.1溶液和试剂
5.2.1.1.1葡萄糖溶液(700 g/L)称取70名葡萄糖加入沸水中,使其完全溶解，冷却斥用蒸馏水定容至100 mL5.2.1.1.2磷酸缓冲溶液（pH=7.5)分别称取磷酸二氢钠1.96g和十二水磷酸氢二钠39.62g，用水溶解并定容到600mL。如需要，调节溶液的 pH到 7.5士0. 05。5. 2. 1. 1.3硫酸镁溶液(61 g/L)称取12.3g七水合硫酸镁（MgSO-7Hz0),加水溶解并定容至100mL。5, 2. 1. 1. 4 高氯酸溶液(210 mL/L)量最市隽的高氯酸试剂21mL，用水定容至500ml。5.2.1.2分析步骤
称取适量固定化酶完整颗粒，用1mL磷酸缓冲溶液（5.2.1.1.2）于3℃～7℃浸池16h后，加1.5 mL磷酸缓冲溶液,0. 5 mL 硫酸镁溶液(5. 2. 1. 1. 3)和 1. 5 mL 葡萄糖溶液(5. 2. 1. 1. 1),再加水调整至总体积5ml.于70℃反应1h。加5mL高氯酸溶液（5.2.1.1.4)终止反应，测定果糖含量。5,2.2适用于游动放线菌(Actinoplanes sp.)生产的葡萄糖异构酶制剂5.2.2.1溶液和试剂
5.2.2.1.1葡萄糖溶液（540g/L)称取54.0g无水葡葡糖加人沸水中，使其完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至100mL；5. 2. 2. 1. 2 磷酸缓冲溶液(pH=7. 0)分别称取磷酸氢一钠12.36g和十水合磷酸二氧钠11.0g，加水溶解并定容至1.L。如需要，调节溶腋的p到7.0±0.05。
5.2.2.1.3硫酸镁溶液(3.66/L）称取0.739g七水合硫酸镁（MgS07Iz0).加水溶解并定容全100mL。5.2.2、1.4硫酸钴溶液(0.46 g/L)称取0.0843g七水合硫酸销(CoS0,7H,0),加水溶解并定容至100mL：2
5.2.2.2分析步骤
GB/T 23533—2009
称取适量固定化酶完整颗粒,用 1 mL 磷酸缓冲溶液(5. 2. 2. 1. 2)于 3 ℃～~7 ℃浸泡 16 h 底,加0.5mL磷酸缓冲溶液,0.5 mL硫酸镁溶液(5.2.2.1.3),0.5 mL硫酸钻溶(5.2.2,1,4)和2,5 ml葡糖溶液(5. 2. 2. 1. 1),再加水调整至总体积 5 mL,于 75 C反应 1 h。加 5 mL高氯酸溶液(5. 2. 1. 1. 4)终止反应,测定果糖含量。
5.2.3果糖的测定
5.2.3.1溶液和试剂
5.2. 3. 1. 1半胱氨酸盐酸盐溶液(15 /L)称取生化试剂半胱氨酸盐酸盐0.375g,用水溶解定容至25mL。5.2.3. 1.2咔唑酒精溶液(1.2 g/L)称取咔噬30.0mg，用无永酒精溶解定容至25ml,放置在棕色瓶中，24h后使用。5.2,3.1.3硫酸溶液
取市售浓硫酸450mI.，在不断搅拌下徐徐倒人190mL水中。5.2.3.1.4标准果糖溶液
称55℃真空燥至恒重的果糖125.0mg，精确至0.0001g，用水定容至25mL（即51ug/nL)，存放于冰箱备用，使用时稀释100倍(即50 μg/1nL)。5.2.3.2分析步骤
5.2.3.2.1绘制标准曲线
取25mL比色管分别加入50μg/ml果糖标准溶液0nL、0.2mL.0.4ml.0.6ml.和0.8mL,分别用蒸馏水补充至1mL后，于每管中加人0.2mI.半胱氨酸盐酸盐溶液（5.2.3.1.1)、6ml硫酸溶液(5.2.3.1.3)，播匀后，立即加人0.2mL咔唑酒精溶液（5.2.3.1.2），摇勾，于60℃水浴中保温10min，取出，用水冷却，用10mn比色Ⅲ于560m波长下比色，以吸光度对果糖作图，即得标准曲线。5.2.3.2.2样品测定
将5.2.1.2或5.2.2.2的反应终止液适当稀释后（使果糖含量在20μ/mL～30μg/mL范围内），准确吸取1.0mL于25ml.比色管，加入0.2mL半胱氨酸盐酸盐溶液、6mL硫酸溶液，摇匀后，立副加入0.2mL咔啦酒精溶液，摇勾，于60℃水浴中保温10min，取出，用水冷却，用10mm比色血于560t波长下比色，记录吸光度后，在标准曲线图上查得相应的果糖含量。5. 2. 4 计算
5.2.4.1酶反应液产生果糖含量的计算酶反应液产生果糖的含量按式(1)计算：X, = m, XnX 1 000
式中：
X，—酶反应液产生果糖的质量，单位为克（g);m
吸光度在标准曲线土查得的果糖质量，单位为微克(μg）：稀释倍数：
质量换算系数。
结果保留至整数位。
5.2.4.2样品酶活力的计算
样品的酶活力按式(2)计算：
CB/T 23533—2009
式中：
样品的酶活力，u/g；
U.--酶活力单位,u
m.样品质量，单位为克(g)。
5.2.5精密度
在重复性条件下获得的两次独立测结果的绝对差值应不超过算术平均值的2%。5.3生产能力
生产能力按式(3)算：
式中：
X，—生产能力，单位为吨每千克(1/kg)；Zs转化糖量的总和,单位为下克(kg)，m
m×1000
一转化吋所用固定化酶的量，单位为千克(Kg）。果葡糖中果糖含量按42%（质量分数)计。5.4强度
固定化酶用60℃蒸馏水浸没，缓慢搅动20h，用两个手指用力挤压，放开后不成浆（或极少量成浆）仍硬，为合格。否则为不合格。5.5干燥失重
5.5.1仪器
5.5.1.1电热干燥箱。
5.5.1.2分析天平:精度为 0.000 1 g。5.5.1, 3称量瓶:50 mmX30 mm。5.5.2分析步骤
用烘计至恒重的称量瓶称取酶样约2g，精确至土0.0002名，置于103℃十2℃电热于燥箱4将盖取下，侧放在称量瓶旁，烘干2h，取出，加盖，放人干媒器中冷却至室温，称量。5.5.3计算
干燥失重按照式(4)计算：
mg -ma ×100
式中：
样品的干燥失重，%；
T燥前称量瓶加样品的质量，单位为克（g)；于燥后称量瓶加样品的质量，单位为克(g)；m
m.-称量瓶的质量，单位为克（g）。所得结果表示至··-位小数。
6捡验规则
6.1批次的确定
由生产单位按照其相应的规则负责确定产品的批号，批内产品的品质应均一.6.2取样规则和样本量
6.2.1取样成均勾分布在整个灌装过程中，或均句分布于灌装后的成品中。（4）
6.2.2取样时应采用适宜的方法保证取样具有代表性，保证取样部位和取样瓶的清洁。对用下微牛物4
捡验的取样，应使用无菌操作。GB/T23533—2009
6.2.3成品描样的样本量见表2。取样的样本量可按照估计的批量参照表2执行，或由4产企业和（或)相关方确定。批取样量不得少于300mL(或300g）),不足者应按比例适当加取。表2成品抽样的样本量
批量/桶或箱
51-~500
样本量/桶或袋
注：批量是指批中所包含的单位商品数，单位为桶或箱。样木量是指样本中所包含的样本单位数，单位为或毅。
6.3检验分类
6.3. 1出厂检验
6.3.1.1产品出！前，应由牛产厂的质量监督检验部门按本标准规定逐批进行检验，检验合格，并附1质量合格证明的，方叼出」。
6.3.1.2检验项目：外观、酶活力、干煤失重和菌蒋总数，6.3.2型式检验
6.3.2.1检验项日：本标准中全部要求项目。6. 3. 2. 2
一般情况下，同类产品的型式检验每年至少进行一次，有下列情况之一者,亦应进行：a）
原辅材料有较大变化时：
更改关键工艺或设备时；
新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时；e
d）出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；国家质量监督检验机构按有关规定带要抽检时。e
6.4判定规则
6.4.1出厂检验和(或)型式检验合格时，由质量检验部门出具产品合格证。6.4.2出厂检验和（或型式检验不合格时，在原批次基础上加倍样分析。如仍不合格，判定该产品为不合格品，不得出厂。
7标志、包装运输及贮存
7.1标志
7.1.1产品的外包装宜使用符合GB/T191要求的标志。7.1.2产品的包装上应贴有牢固的标签。标志内容应包括品名、产地、厂名、规格（酶活力）、生产日期、批号或代号、保质期等。
7.2包装
产品的内包装和（或)包装容器的内涂料应采用国家批准的材料，食品工业用产品应符合相应的食品包装用/食品容器卫生标雅的材料。7.3运输
产品在运输过程中应轻拿轻放，严防雨淋和曝晒。运输工具应清洁、无毒、无污染。严禁与有毒、有害、有腐蚀性的物质混装混运。7.4 贮存
产品应贮存在阴凉干燥的环境下。严禁与有毒、有害、有腐蚀性的物质同存，5
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GB/T23533--2009
8保质期
8.1在4℃以下固定化葡萄糖异构酶制剂保质期不少于90天，企业应按上述要求只体标示，在保质期内实测酶活力不应低于标示酶活力。8.2酶制剂是含有生物活性物质的产品。在保质期外，保存期内，活力可能降低，但仍具有使用价值。
A.1范围
附录A
（资料性附录）
固定化葡萄糖异构酶活力的测定本方法适用于测定样品中固定化葡萄糖异构酶的活力。A.2原理和反应条件
A.2.1 原理
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利用葡荐糖异构酶可以将葡葡糖转化为果糖的原理,把酶装填在柱子中并在标推条件下与葡萄糖浆反应。用旋光仪捡测由葡萄糖转化来的果糖，从转化速率计算酶的活力A.2.2反应条件
葡萄瓣：450g/kg，
底物pH:7.5。
温度:60℃。
Mg*- :99 mg/L(1. 0 g/L MgSO, - 7H,O) .Ca* :<2 μg/g.
激活因子，O2：100μg/g(0.18g/LNaS,O,）转化率：0.40~0.45。
缓冲液,NazCO,:2 mmol/L。
A.3缩略语
下列缩略语适用于本附录。
IGIU:immubilizedglucoscisoraeraseunits，葡糖异构酶的活力单位。A. 4 专一性和灵敏度
本方法的定量限为160IGIU/g。
注：HGIU表示在标准条件下每分钟转化1mol葡葡糖所露的酶量。A.5仪器和设备
A,5.1温水浴:精度±0.2℃。
A,5.2 2. 5 cmX20 cm 玻璃柱。A.5.3变速端动泵。
A.5.4折光仪。
A.5.5自动进样器。
A.6试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。A.6.1硫酸镁储蓄液(226 g/L)
称取七水合硫酸镁463.0 g，用水溶解并定容到1000 tuL。7
bt
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A.6.2硫酸镁工作液(0.226 /L)
取上述溶液1.0mI,用水定容到1000ml。该溶液使用前配制A.6.3氢氧化钠溶液1(40 g/L)
取氢氧化钠片剂40.0g，用水溶解并定容到1000nL。A.6.4氢氧化钠溶液2(160g/L）
取氢氮化钠片剂160.0g,用水溶解并定容到1000 mL。A,6.5碳酸钠溶液(105.99g/L)
取碳酸钠105.99 g，用水溶解并定容到1 000 mL。A.6.6硫酸溶液
取市售浓硫酸27.2mL，在搅拌的条件下缓慢倒人一定量的水中，待冷却到室温后用水定容到1 000 mL.
A,6.7葡萄糖底物（450g/kg.pH=7.5）分称取539.0g无水葡萄糖、1.0g七水合硫酸镁，0.21g碳酸钠和0.18g焦亚硫酸钠，在加热(最商70℃)和搅拌下完全溶于700mL去离了水中，冷却到25C,用0.5mal/LH,SO.(A.6.6)谢节pH到7.50±0.03,然后用去离了水定穿至1000mL或定重到1199g。然后分别取硫酸镁储备液（A,6.1)87.0mL碳酸钠溶液（A.6.5)80.0mL,焦亚硫酸钠7.12g利硫酸溶液(A.6.G)约28.5mL到I:述定容的葡萄糖底物中，搅拌均句。检查溶液的PH,如需要，用氢氧化钠溶液（A.6.4)或硫酸溶液调节到7.50上0.03。A.7标准对照品
如可能，在每次试验中应加一个标准对照品，以检查測定的稳定性。如标准对照品的检测值与标志值超过精密度所规定的范围，需要重新进行试验。A, 8 试验步骤
分析试验持续3天。其中第一天主要用来安装设备和样品的填柱处理，第一天用来进行预试验第三天用来正式测定样品的活力。以下分别描述第一天、第天和篇三天的试验步骤。A, 8. 1 第～天
A.8.1.1准备底物
按照 A,6.7所规定的方法准备底物。A.8.1.2准备水浴
水浴锅中加水直到足够浸没玻璃柱(A.5.2)。设定温度到G0℃。达到温度后将空玻璃柱放人水浴中，
A. 8. 1. 3流速选择和样品量
依据预期的样品酶活力选择样品母和配套的流速（见表A，1）。使用前样品的预期活方先乘以0.7作校正。
将管线接到变速蠕动泵和玻璃柱上。启动泵使管路环线中充满底物。表 A.1样品与流速的选择
钻计活力/ICGIU
样品质量/g
流速/（ml./min）
估计活力/IGIU
A.8. 1. 4样品溶胀
表A.1（续）
样品质量/g
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流速/(mL/min)
称取一定量的样品到100mL烧杯中，加人约40mL底物：放置60min。头15min每5min搅拌一次，然后定时搅拌。
A.8.1.5装填柱子
将溶胀的酶搅拌后注人玻璃柱中，烧杯怀中剩余的酶硫酸镁工作液（A.6.2)清洗注入杜中，待溶胀的酶沉降下来，将浸透1.88tmmo1/L的硫酸镁T作液的棉塞（约0.69g~~0.71多)推人柱中，距酶表面药 1 cm～2 cm。尽量避免棉塞中有气泡。待柱中充满液体后将柱子盖上，盖子要固定在架了上：将架子架作水浴中，架子的两翼要在水浴外。然后将泵管连在盖于上，将出口连上山口管。捡查一下，保证所有出口都能滴液。接着将架子两翼折好，架子放下深入到水浴中，盖上水浴盖。再检查一下，保证所有出口都能滴液及所有出口管都连在出口上。
如果山口管不滴液则有可能被堵塞。这种情况下检查是否少量固定化酶堵塞了通路。如需要，可以采用反通液的方法来尝试解决。A, 8,2 第二天
在第二天和第三天收集转化产物时需保持反应环境温度的稳定。由于水浴将散发出大量的热，可以考虑采用使用空调的方法来调节环境温度。第二天收集的第一个转化产物作为葡翻糖转化为果糖过程的参考品。这个对照品可以用来调节流速以保证第三天活力测定时转化率在0.40～~0.45之间。A, 8,2, 1pII 调节
捡查底物 pH 为 7. 5+0. 03。读底物的折光值。如果底物的pII不是7.5+0.03,用硫酸溶液(A.6.6)或氢氧化钠溶液1(A6.3)调节。调节pII2h之内不能取样测定。
如果pH在范围之内，收集转化产物约10mL用于下-.步测试。A. 8,2.2 测试
向所有收集的转化产物中加人0.1mL氢氧化钠溶液1(A.6.4)以使变旋作用史快达到平衡。从完成收集转化产物到究成测试应在45rmnin之内，这是为了防止然发。收集的样品用旋光数值测定转化率。
样品可按下列顺序测试：
用水设零→2次底物-→2次水转化产物，重复操作直到完成所有分析。最后用2次水、2次乙醇和2次水清洗仪器。GB/T 23533—2009
记录样品的折光值、样品称重和旋光值。应做检查以保证折光常数在0.992～~1.008之间。如果折光常数超出范围，新光值和旋光值要重新测试A.8.2.3转化率
要保证转化率在0.10-~0.45之间：如果不行，需要考虑改变流速：转化率>0.15：考惠更高的流速；转化率0.40：考虑更低的流速。A.8.3第三天
在测定转化率48h后收集转化产物。检查底物pH为7.50.03。读取底物的折光值，将转化产物收集在玻璃瓶中，测净重。在1h和3h后分别从玻璃瓶中取样。测定样品的折光值。两次测定的相关系数CV应≤2%A.9计算
A,9.1计算方法
本反应为可逆反应，果糖浓度的上并与葡菊糖的浓度以及果糖形成速度之间的关系十分复杂。A.9.1.1葡萄糖溶液密度的计算
对于浓度为450g/L的葡郁糖溶液，密度按照式(A.1)计算：p=0.00516×DS+0.9663
式中+
r——底物密度,单位为克每毫升(g/mI);DS-
一底物葡萄糖含量。
A.9. 1.2转化率的计算
利用旋光仪的读数，用式（A,2)计算转化率：A=
式中：
A-计算的转化率；
a.葡糖的特征旋光度（实測值.20℃)果糖的特征旋光度（实测值，20℃）；-
·样品旋光度；
样品池长，10cm；
底物葡萄糖含量；
底物密度，单位为克每毫（g/mI)。A.9.1.3酶活力的计算
用式(A.3)计算样品的酶活力：
X-: 0. 926 ×
式中：免费标准bzxz.net
样品的酶活力，IGIU/g；
转化因子（g/h到mruol/min);
流速，单位为克每小时（g/h）；酶样品的质量，单位为克（多）；ag ×100
acXLXDSxpl
X Xe × IS × l1
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