GB/T 27532-2011
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GB/T 27532-2011 犬瘟热诊断技术
GB/T27532-2011
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1CS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T275322011
犬瘟热诊断技术
Diagnostic technigues for canine distemper2011-11-21 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-03-01实施
本标准的附录A和附录B为资料性隔录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T 27532—2011
本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局.中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标雅主要起草人：单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、衰小远，孙园园、马品。1
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一范围
犬蕴热诊断技术
GB/T 27532——2011
本标准规定了犬热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的体作方法。
本标准适用于犬癌热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR 检测适用丁:犬遮热的病原诊断。2试剂和材料
改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配方参见附录A。2.2非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）。2.3
磷酸盐缓冲被（PBS)：配制参见附录A，2.4青霉索、链霉素：配方参见附录A。2.5
CDV阳性血清：中和抗体效价1*1024。CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清，2. 7
酶结合物：HRP标记的葡药球菌A蛋白（SPA）。2.8
底物猝液:配制参见附录 A。
过氧化氢甲醇溶液:配制参见附录A。2.9
盐酸酒精游液：配制参见附录A。胺蛋白酶溶液:配制参见附录 A。Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μI.，-20C保存，逆转录酶及10倍道转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U/L，一20℃保存。RNA醛抑制剂(40 C/μL):—20 C保存dNTP:含 dATP,dGTP,dCTP,dTTP 各 10 mmol/L,一20 C保存2.16
引物：浓度为20 μmol/,其序列如下：上游引物(CDVF),5'CGAGTCTTTGAGATAGGGTT3下游引物(CDVR).5'CCTCCAAAGGGITCCCATGA3'2. 17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物,浓度为50μmo1/L，一20 ℃保存。2.181
DEFC水：自配（参见附录A?，或购买商品化DEPC水。Trizol试剂;4保存。
异两醇：使用前预冷至一20，
75为乙醇：用新开启的无水乙醇和DEFC水配制，使用前预冷至一20℃2.22
1. 5 mL 无 RNA 酶的 Eppendorl 管0.2mL无RNA酶的FCR薄壁管。
器材和设备
细胞培养瓶（甲号瓶），
3.2二氧化碳培养箱。
3.3恒温水浴箱（℃～100℃）
3.4普通光学显微镜。
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GB/T27532—2011
3.50.45μm微孔滤膜。
3.6离心机，
3. 7 PCR 扩增仪。
3.8水半电泳仪。
3.940个小孔的室玻片。
3. 10冷冻切片机。
商速台式冷冻离心机：可控温至4心、离心速度可送12000g以上。3. 11
凝胶成像系统，
4临检查
4. 1 临床症状
4.1.1病火体温升高垒40℃以上，章流清递至脓性鼻汁，浓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肿炎症状。4.1.2胺下可见米粒大丘掺。
4. 1. 3病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状,头、颈、肢抽滴，4.2病理变化
4.2.1新生幼犬感染CDV表现胸腺娄缩，成车犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。4.2.2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。4.2.3中板神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。4.2.4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性位于跑浆内.直径［μ1～5um，可在黏膜上皮细脑、网状细胞、白细胞，种经胶质细咆和冲经元中发现，核内包涵体多位于被上皮细胞，腺上皮细胞和神经节细胞4.3判定
若临床症状符合 4. 1. 1 或 4. 1. 3 且出现 4. 2. 4 的病理变化,则可判定疑似犬瘟热,其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用病毒分离,免疫避检测,免疫组织化学检测和 RT-PCR检测等方法确诊。
5病毒分离
5.1样品采集和处理
5.1.1活犬可采集泪羧、异液，睡液粪便，病死人可采集开，弹、肺等组织器官，5.1.2上述样品用无血清DMEM制成20%组织甚液，1G00Gr/min离心20min，取上清液，经0.15μm微孔滥膜过滤.滤波用于CDV分离。5.2操作方法
5.2.1细胞培养
用含8%新生牛班清的DMEM培养基在细胞培养瓶（巾号瓶)培释VeIO细胞，置37℃一氧化碳培养籍，单层细脑长至80为～90%时，接种样品上清。5.2. 2病料接种
取 0. 1 mL 处理好的样品上消接种 Vero 细跑，置 37 ℃ 二氧化碳培养箱吸附 1 h.加入无血清DMEM继续培养5d-7d，观察结果。5. 3结果判定
若接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后白传三代，如仍无细胞病变，则判为CDV病原分离阴性。若Vro 细跑培养 4 d-5 d 出现胞病变(如细胞变圆、跑浆内颗粒变性和空泡膨成,随后形成合题体，并指跑浆中出现包涵体，可用免疫静检测、免疫组织化学检测和RT-PCR三种方法之一进行确诊、
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6免疫酶检测
6. 1 操作方法
GB/T27532—2011
6. 1. 1将 CDV标准辣和待鉴定的样品分别接种 Vero细胞,接种厉 5 d~7 d,精变达0%~75%时,胰蛋凹酶消化分散感染细胞，PBS液洗涤3次后，稀释至1×10个/mL细跑。取有40个小孔的室玻片，每孔滴加10μl，室温白然于煤后，冷丙酮（4℃）固定1Gmin。密封包装，置一20℃备用，6.1.2取出室坡片室温干爆后、每份10倍释的CDV阳性血清利阴性血清，每份血清滴加到两个病毒细胞孔和一个正常细咆孔，置湿盒内，臀恒温水浴箱37℃孵育min。6. 1. 3PBS漂洗3次.每次 5 min.室温干燥。6。1.4滴加1=100稀释的酶结合物，胃湿盒内，用恒温水浴箱37C孵育301min，6.1.5PBS漂洗3次，每次5min。
6.1.6将室玻片放人底物溶液中室温下显色5min~10min。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。6.1.7吹下后，在通光学显微镜下观察，判定结果。6.2结果判定
6.2.1落CT)V阴性血清与正常细炮和病毒感染细胞反成均无色，凡CDV阳性血清与正带细胞反应无色，与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色，则判定阴、阳性对照成立。6.2.2在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈无色，判为CDV朗性，相应动物火癌热感染阴性。6.2.3在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈无色，而与CDV阳性血清反应呈棕黄色或棕褐色，判为CDV阳性，相应动物犬癌热感染阳性。7免疫组织化学检测
7.1样品处理
对疑似CD的病死大或扑杀大，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存，送检。
7.2操作方法
7.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片机切片风后用丙副固定10min～15tnin，新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片（切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂：以防脱）。7.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37t作用20minc7.2.3胰蛋口酶消化：室温下，用膜蛋白酶溶液消化处班2min，以便充分暴露抗原。7.2.4漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。7.2.5封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10帮释的正带马血清，37℃湿盒中解育30 min.
7.2.6加10倍稀释的CDV性血清或阴性血清，37℃湿盒中孵育1h或37℃盒中孵育30min后4过夜。
7.2.7漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。7.2. 8加1：100 稀释的酶结合物,37 ℃混盒孵育 1 h。7.2.9源洗：PBS漂洗3次每次5min。7.2.10底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min~10min后漂洗，7.2.11从90%乙醇开始脱水、透明、封片、替通光学显微镜观察。7.2.12试验同时设阳性、阴性血消对照。3
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7.3结果判定
7.3.1被检组织与阴性血清作用后应无着染、若出现黄色或棕褐色着架，判定阴性对照不成立、应重复实验，
7.3.2在符合7.3.1的条件下，被检组织与CDV阳性血清作用后本底清晰.细胞浆内是现黄色或棕橱色着染,判为 CDV 阳性,相应动物犬瘟热感染阳性。8RT-FCR 检测
8.1病料的采集及处理
采集的样品包括犬的汨液，液、睡液、类便及病死火的肝、脾、肺等组织器官，将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心t5min，收集上清液待检。口腔拭子，粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原外离培养的样品，妆集细跑流淀待检。CDV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。
8.2RNA抽提
分别取100μl.待检样品，CDV阳性样品和阴性样品的上清液各装人1.5mLRVA酶的Eppen-dorf管，加人1mLTrizol试剂用枪头充分吹打20次--30次，13000g离心15 mi;取上层水相，500 μl.异丙醇,颠倒数次混匀，一20 ℃放置 20 min+13 D00g离心10 min:弃上清,沉淀用 1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗;8 000g离心10 min;弃上清，沉淀室温下煤10 min+加20μLDEPC.水溶解RNA洗淀。RNA溶液在2h内进行逆转录合成cDNA模板。另外，RNA抽提也可采月市售的商品化RNA抽提试剂盒进行，
8.3cDNA模板制备
取 17 μL RNA 溶液:加 10 倍逆转录酶浓缩缓冲 2. uI..dNTP 1, 5 μI.、随机引物 2 μL,RNA 酶抑制剂1μL.逆转录酶1μL，室温放置l0min后FCR仪上经42℃、60min.7u℃、10minB.4PCR检测
在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq醇浓缩绥冲液2.5产L.dVTP0.5μL、Taq酶0,5 μL,cDNA 模板 2 μL、上游引物和下游引物(CDVF,CDVR)各 0, 5 μL、-蒸水 18. 5 μL,配制 PCR检测体系。格PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94C变性2min：再94℃、30s，55℃，30s，72℃、40s进行35个循环；最后72℃.3mi，用TBE电泳缨冲液配制1.5%的琼脂糖平板<含0.5 μg/mL EB,参见附录 A 中 A. 11,将平板放人水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10 μLPCR产物利 2 μL 划拌缓冲液(6×)混勾后加人样品孔。在电泳时设立 DNA 标推分子量作对照。5V/cm电泳药30min，当漠粉蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。8.5结果判定
8.5.1经RT-PCR检测，CDV阳性对照样品可扩增出人小为455bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，香则试验结果视为光效。8.5. 2在符合8. 5. 1 的条件下,若待检样品扩增出了大小为455 bp的核酸片段，则初步判定犬瘟热病毒核酸阳性，若待检拌品无扩增条带或扩增条带大小不为155bP+则判定犬瘟热病毒核酸阴性。8,5.3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性≥90%,则可确诊为犬瘟热病毒核酸阳性,否则判定犬瘟热病毒核酸阴性8.5. 4若犬癌热病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判定犬瘟热病毒感染阳性。4
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A.1MIEM高糖)培养液的配制
附录A
(资料性附录)
试剂及其配制
GB/T 27532—2011
量取去离子水950mL，置于适宜的容器中。将DMEM粉剂108加十30的去离了水中，近加边搅拌。每1000mL培养液加3.7g磁酸氢钠。加去离子水至1000mL，用1mo1/L氢氧化钠或盐酸将培养液1H值调至6.9~7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。立即用孔径0.45μm的微孔滤膜正压过滤除菌，4冰箱保存备用，
A.2磷酸盐经冲液(PBS,0.01 mo/L.PH7.4)氯花钠
氯化钾
磷酸二氢钾
十二水磷酸氢二
蒸馏水
A.3青霉索、链霉素
加至 1 000 ml.
取注射用青舞素和链霖素溶解汀三蒸水中使每毫升含青舞素、链霉素各5万单位（1g），除菌过滤，用时按1001nL1610-15培养液加0.2mL.使青需案、链每索的最终浓度各为100单位（ug）A.4底物溶液
3，3二腰基联率胺酸搬(DAB)
30牙过氧化氢
滤纸过滤后使用，现用现配。
A.5过氧化氧甲醇溶液(0.3%)
30关过氧化氢
现用现配，
A.6盐酸酒精溶液（1%）
70为乙醇
A.7胰蛋白醇溶液(0.5%)
胰蛋白酶
低温保存。使用时，用PBS为 0.05%。40mg
100 mL
CB/I27532—2011
A. 8DEPC 溶液(0. 1%)
蒸馏水
加至 1 000 mL
磁力搅拌至溶解，高医灭菌121℃，30min后4它冰箱保存备而。A.9
生理盐水
称取9g无水氟化钠溶于1000mL去离子水中配成0.9%牛埋盐水，121,3℃灭菌15min。5×TBE电泳缓冲液下载标准就来标准下载网
每升三蒸水中加人三羟甲基氮基甲烷（Tris)54.0g，乙二胺四乙酸（EDTA）2.9mg，硼酸27.5&，用 5 r:ol/L的盐酸调 pH 值垒 8. 0 ,A.11EB核酸染色剂
在10mL.三蒸水中加人100mg溴化乙锭（EB)配制或10mg/tnL的浓缩液2加样缓冲液（6×）
每100ml.三热水中加入漠酚蓝0.25g和蔗糖40g6
附录B
(资料性附录）
犬热病毒 RT-PCR 扩增核酸片段参考序列cgagtctttg agatagggtt catcaaacgg tggctgaaig acalgccatlactccagaca accaactata tggtcctccc ggagaattet aaagetgaggtgtgtactatagcagtgRgcgagctgacac tggcttcctt gtgtgtagatagagcaccgtattattalatcatgacigcaatggtccacatgzcagigttctaglagig acgctgggaa tatttggggc aacaccgaig aatczagtagaagaggtgat accigtcgct catccatcagtagaaaagatacalatcacaaatceccgtg gtttcataaa agattcagta gcaacctgga tggtgcctgcattggtetrt gagcaacaag saggacaaaa aaattgtctg gegtcgcttgtcaaagaaa atcctaccct atgtgcaacc aaacatcatg ggaaccctttgag
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本标准的附录A和附录B为资料性隔录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。GB/T 27532—2011
本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局.中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标雅主要起草人：单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、衰小远，孙园园、马品。1
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一范围
犬蕴热诊断技术
GB/T 27532——2011
本标准规定了犬热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的体作方法。
本标准适用于犬癌热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR 检测适用丁:犬遮热的病原诊断。2试剂和材料
改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配方参见附录A。2.2非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）。2.3
磷酸盐缓冲被（PBS)：配制参见附录A，2.4青霉索、链霉素：配方参见附录A。2.5
CDV阳性血清：中和抗体效价1*1024。CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清，2. 7
酶结合物：HRP标记的葡药球菌A蛋白（SPA）。2.8
底物猝液:配制参见附录 A。
过氧化氢甲醇溶液:配制参见附录A。2.9
盐酸酒精游液：配制参见附录A。胺蛋白酶溶液:配制参见附录 A。Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μI.，-20C保存，逆转录酶及10倍道转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U/L，一20℃保存。RNA醛抑制剂(40 C/μL):—20 C保存dNTP:含 dATP,dGTP,dCTP,dTTP 各 10 mmol/L,一20 C保存2.16
引物：浓度为20 μmol/,其序列如下：上游引物(CDVF),5'CGAGTCTTTGAGATAGGGTT3下游引物(CDVR).5'CCTCCAAAGGGITCCCATGA3'2. 17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物,浓度为50μmo1/L，一20 ℃保存。2.181
DEFC水：自配（参见附录A?，或购买商品化DEPC水。Trizol试剂;4保存。
异两醇：使用前预冷至一20，
75为乙醇：用新开启的无水乙醇和DEFC水配制，使用前预冷至一20℃2.22
1. 5 mL 无 RNA 酶的 Eppendorl 管0.2mL无RNA酶的FCR薄壁管。
器材和设备
细胞培养瓶（甲号瓶），
3.2二氧化碳培养箱。
3.3恒温水浴箱（℃～100℃）
3.4普通光学显微镜。
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3.50.45μm微孔滤膜。
3.6离心机，
3. 7 PCR 扩增仪。
3.8水半电泳仪。
3.940个小孔的室玻片。
3. 10冷冻切片机。
商速台式冷冻离心机：可控温至4心、离心速度可送12000g以上。3. 11
凝胶成像系统，
4临检查
4. 1 临床症状
4.1.1病火体温升高垒40℃以上，章流清递至脓性鼻汁，浓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肿炎症状。4.1.2胺下可见米粒大丘掺。
4. 1. 3病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状,头、颈、肢抽滴，4.2病理变化
4.2.1新生幼犬感染CDV表现胸腺娄缩，成车犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。4.2.2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。4.2.3中板神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。4.2.4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性位于跑浆内.直径［μ1～5um，可在黏膜上皮细脑、网状细胞、白细胞，种经胶质细咆和冲经元中发现，核内包涵体多位于被上皮细胞，腺上皮细胞和神经节细胞4.3判定
若临床症状符合 4. 1. 1 或 4. 1. 3 且出现 4. 2. 4 的病理变化,则可判定疑似犬瘟热,其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用病毒分离,免疫避检测,免疫组织化学检测和 RT-PCR检测等方法确诊。
5病毒分离
5.1样品采集和处理
5.1.1活犬可采集泪羧、异液，睡液粪便，病死人可采集开，弹、肺等组织器官，5.1.2上述样品用无血清DMEM制成20%组织甚液，1G00Gr/min离心20min，取上清液，经0.15μm微孔滥膜过滤.滤波用于CDV分离。5.2操作方法
5.2.1细胞培养
用含8%新生牛班清的DMEM培养基在细胞培养瓶（巾号瓶)培释VeIO细胞，置37℃一氧化碳培养籍，单层细脑长至80为～90%时，接种样品上清。5.2. 2病料接种
取 0. 1 mL 处理好的样品上消接种 Vero 细跑，置 37 ℃ 二氧化碳培养箱吸附 1 h.加入无血清DMEM继续培养5d-7d，观察结果。5. 3结果判定
若接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后白传三代，如仍无细胞病变，则判为CDV病原分离阴性。若Vro 细跑培养 4 d-5 d 出现胞病变(如细胞变圆、跑浆内颗粒变性和空泡膨成,随后形成合题体，并指跑浆中出现包涵体，可用免疫静检测、免疫组织化学检测和RT-PCR三种方法之一进行确诊、
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6免疫酶检测
6. 1 操作方法
GB/T27532—2011
6. 1. 1将 CDV标准辣和待鉴定的样品分别接种 Vero细胞,接种厉 5 d~7 d,精变达0%~75%时,胰蛋凹酶消化分散感染细胞，PBS液洗涤3次后，稀释至1×10个/mL细跑。取有40个小孔的室玻片，每孔滴加10μl，室温白然于煤后，冷丙酮（4℃）固定1Gmin。密封包装，置一20℃备用，6.1.2取出室坡片室温干爆后、每份10倍释的CDV阳性血清利阴性血清，每份血清滴加到两个病毒细胞孔和一个正常细咆孔，置湿盒内，臀恒温水浴箱37℃孵育min。6. 1. 3PBS漂洗3次.每次 5 min.室温干燥。6。1.4滴加1=100稀释的酶结合物，胃湿盒内，用恒温水浴箱37C孵育301min，6.1.5PBS漂洗3次，每次5min。
6.1.6将室玻片放人底物溶液中室温下显色5min~10min。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。6.1.7吹下后，在通光学显微镜下观察，判定结果。6.2结果判定
6.2.1落CT)V阴性血清与正常细炮和病毒感染细胞反成均无色，凡CDV阳性血清与正带细胞反应无色，与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色，则判定阴、阳性对照成立。6.2.2在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈无色，判为CDV朗性，相应动物火癌热感染阴性。6.2.3在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈无色，而与CDV阳性血清反应呈棕黄色或棕褐色，判为CDV阳性，相应动物犬癌热感染阳性。7免疫组织化学检测
7.1样品处理
对疑似CD的病死大或扑杀大，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存，送检。
7.2操作方法
7.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片机切片风后用丙副固定10min～15tnin，新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片（切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂：以防脱）。7.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37t作用20minc7.2.3胰蛋口酶消化：室温下，用膜蛋白酶溶液消化处班2min，以便充分暴露抗原。7.2.4漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。7.2.5封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10帮释的正带马血清，37℃湿盒中解育30 min.
7.2.6加10倍稀释的CDV性血清或阴性血清，37℃湿盒中孵育1h或37℃盒中孵育30min后4过夜。
7.2.7漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。7.2. 8加1：100 稀释的酶结合物,37 ℃混盒孵育 1 h。7.2.9源洗：PBS漂洗3次每次5min。7.2.10底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min~10min后漂洗，7.2.11从90%乙醇开始脱水、透明、封片、替通光学显微镜观察。7.2.12试验同时设阳性、阴性血消对照。3
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GB/T27532—2011
7.3结果判定
7.3.1被检组织与阴性血清作用后应无着染、若出现黄色或棕褐色着架，判定阴性对照不成立、应重复实验，
7.3.2在符合7.3.1的条件下，被检组织与CDV阳性血清作用后本底清晰.细胞浆内是现黄色或棕橱色着染,判为 CDV 阳性,相应动物犬瘟热感染阳性。8RT-FCR 检测
8.1病料的采集及处理
采集的样品包括犬的汨液，液、睡液、类便及病死火的肝、脾、肺等组织器官，将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心t5min，收集上清液待检。口腔拭子，粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原外离培养的样品，妆集细跑流淀待检。CDV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。
8.2RNA抽提
分别取100μl.待检样品，CDV阳性样品和阴性样品的上清液各装人1.5mLRVA酶的Eppen-dorf管，加人1mLTrizol试剂用枪头充分吹打20次--30次，13000g离心15 mi;取上层水相，500 μl.异丙醇,颠倒数次混匀，一20 ℃放置 20 min+13 D00g离心10 min:弃上清,沉淀用 1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗;8 000g离心10 min;弃上清，沉淀室温下煤10 min+加20μLDEPC.水溶解RNA洗淀。RNA溶液在2h内进行逆转录合成cDNA模板。另外，RNA抽提也可采月市售的商品化RNA抽提试剂盒进行，
8.3cDNA模板制备
取 17 μL RNA 溶液:加 10 倍逆转录酶浓缩缓冲 2. uI..dNTP 1, 5 μI.、随机引物 2 μL,RNA 酶抑制剂1μL.逆转录酶1μL，室温放置l0min后FCR仪上经42℃、60min.7u℃、10minB.4PCR检测
在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq醇浓缩绥冲液2.5产L.dVTP0.5μL、Taq酶0,5 μL,cDNA 模板 2 μL、上游引物和下游引物(CDVF,CDVR)各 0, 5 μL、-蒸水 18. 5 μL,配制 PCR检测体系。格PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94C变性2min：再94℃、30s，55℃，30s，72℃、40s进行35个循环；最后72℃.3mi，用TBE电泳缨冲液配制1.5%的琼脂糖平板<含0.5 μg/mL EB,参见附录 A 中 A. 11,将平板放人水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10 μLPCR产物利 2 μL 划拌缓冲液(6×)混勾后加人样品孔。在电泳时设立 DNA 标推分子量作对照。5V/cm电泳药30min，当漠粉蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。8.5结果判定
8.5.1经RT-PCR检测，CDV阳性对照样品可扩增出人小为455bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，香则试验结果视为光效。8.5. 2在符合8. 5. 1 的条件下,若待检样品扩增出了大小为455 bp的核酸片段，则初步判定犬瘟热病毒核酸阳性，若待检拌品无扩增条带或扩增条带大小不为155bP+则判定犬瘟热病毒核酸阴性。8,5.3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性≥90%,则可确诊为犬瘟热病毒核酸阳性,否则判定犬瘟热病毒核酸阴性8.5. 4若犬癌热病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判定犬瘟热病毒感染阳性。4
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A.1MIEM高糖)培养液的配制
附录A
(资料性附录)
试剂及其配制
GB/T 27532—2011
量取去离子水950mL，置于适宜的容器中。将DMEM粉剂108加十30的去离了水中，近加边搅拌。每1000mL培养液加3.7g磁酸氢钠。加去离子水至1000mL，用1mo1/L氢氧化钠或盐酸将培养液1H值调至6.9~7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。立即用孔径0.45μm的微孔滤膜正压过滤除菌，4冰箱保存备用，
A.2磷酸盐经冲液(PBS,0.01 mo/L.PH7.4)氯花钠
氯化钾
磷酸二氢钾
十二水磷酸氢二
蒸馏水
A.3青霉索、链霉素
加至 1 000 ml.
取注射用青舞素和链霖素溶解汀三蒸水中使每毫升含青舞素、链霉素各5万单位（1g），除菌过滤，用时按1001nL1610-15培养液加0.2mL.使青需案、链每索的最终浓度各为100单位（ug）A.4底物溶液
3，3二腰基联率胺酸搬(DAB)
30牙过氧化氢
滤纸过滤后使用，现用现配。
A.5过氧化氧甲醇溶液(0.3%)
30关过氧化氢
现用现配，
A.6盐酸酒精溶液（1%）
70为乙醇
A.7胰蛋白醇溶液(0.5%)
胰蛋白酶
低温保存。使用时，用PBS为 0.05%。40mg
100 mL
CB/I27532—2011
A. 8DEPC 溶液(0. 1%)
蒸馏水
加至 1 000 mL
磁力搅拌至溶解，高医灭菌121℃，30min后4它冰箱保存备而。A.9
生理盐水
称取9g无水氟化钠溶于1000mL去离子水中配成0.9%牛埋盐水，121,3℃灭菌15min。5×TBE电泳缓冲液下载标准就来标准下载网
每升三蒸水中加人三羟甲基氮基甲烷（Tris)54.0g，乙二胺四乙酸（EDTA）2.9mg，硼酸27.5&，用 5 r:ol/L的盐酸调 pH 值垒 8. 0 ,A.11EB核酸染色剂
在10mL.三蒸水中加人100mg溴化乙锭（EB)配制或10mg/tnL的浓缩液2加样缓冲液（6×）
每100ml.三热水中加入漠酚蓝0.25g和蔗糖40g6
附录B
(资料性附录）
犬热病毒 RT-PCR 扩增核酸片段参考序列cgagtctttg agatagggtt catcaaacgg tggctgaaig acalgccatlactccagaca accaactata tggtcctccc ggagaattet aaagetgaggtgtgtactatagcagtgRgcgagctgacac tggcttcctt gtgtgtagatagagcaccgtattattalatcatgacigcaatggtccacatgzcagigttctaglagig acgctgggaa tatttggggc aacaccgaig aatczagtagaagaggtgat accigtcgct catccatcagtagaaaagatacalatcacaaatceccgtg gtttcataaa agattcagta gcaacctgga tggtgcctgcattggtetrt gagcaacaag saggacaaaa aaattgtctg gegtcgcttgtcaaagaaa atcctaccct atgtgcaacc aaacatcatg ggaaccctttgag
GB/T27532—2011
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