HY/T 140-2011 海洋微型底栖生物调查规范 HY/T140-2011 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
本标准确定了海洋微型底栖生物调查的基本要求,确立了采样和固定、分离和培养、离心和提取、染色和制片、定性和定量分析等一般规定和方法。 本标准适用于潮间带、浅海和深海等不同生境的海洋微型底栖生物调查。
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由中国科学院海洋研究所提出。
本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。
本标准起草单位:中国科学院海洋研究所。
本标准主要起草人:类彦立、徐奎栋。
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GB/T12763.1 海洋调查规范 第1部分:总则
GB/T12763.6 海洋调查规范 第6部分:海洋生物调查
前言 Ⅲ
引言 Ⅳ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 基本要求 1
4.1 主要观测量 1
4.2 辅助观测量 1
4.3 观测站点与层次设计 1
4.4 文档与图件 2
4.5 调查的技术要求和程序步骤 2
4.6 质量计划和质量控制措施 2
5 采样和固定 2
5.1 海上采样 2
5.2 潮间带采样 3
5.3 活体样品采集 3
5.4 采样管 3
5.5 样品处理 3
5.6 环境因子的测定 3
6 活体微型底栖生物调查 4
6.1 方法概述 4
6.2 设备材料 4
6.3 样品分离和培养 4
6.4 观察和记录分析 5
7 底栖微藻和底栖细菌调查 5
7.1 方法概述 5
7.2 用于实验室操作的荧光染色 5
7.3 用于船上操作的荧光染色 7
8 底栖原生动物调查 8
8.1 方法概述 8
8.2 工具和试剂 8
8.3 Percoll离心分离技术 8
8.4 Ludox离心分离技术 9
8.5 定量蛋白银染色技术 10
9 微型底栖生物的定性和定量分析 13
9.1 显微镜检分析 13
9.2 常用群落参数的计算 13
9.3 填写报表 14
9.4 统计分析和绘图 14
10 调查成果内容及要求 14
10.1 原始记录 14
10.2 文档 15
10.3 元数据 16
10.4 图件 17
10.5 调查结论 17
10.6 成果的质量评估 17
附录A (规范性附录) 微型底栖生物的几个主要类群图 18
附录B(资料性附录) 微型底栖生物采样和镜检记录表 19
附录C (规范性附录) 微型底栖生物调查的几种仪器设备图 21
附录D (规范性附录) 微型底栖生物的生物量转换系数表 22
附录E (规范性附录) 微型底栖生物调查的几个关键技术流程图 23
附录F(规范性附录) 微型底栖生物的生物体积计算公式 25
附录G (规范性附录) 各种溶液的配方和配制 27
参考文献 29
图A.1 微型底栖生物的几个主要类群图 18
图C.1 真空过滤系统图 21
图C.2 滤膜筐图 21
图E.1 底栖微藻和细菌萤光染色技术流程图 23
图E.2 Percoll离心分离技术流程图 23
图E.3 Ludox离心分离技术流程图 24
图E.4 定量蛋白银染色(QPS)技术流程图 24
图F.1 微型底栖生物的生物体积计算公式图 25
表B.1 微型底栖生物采样记录表 19
表B.2 微型底栖生物镜检记录表 20
表D.1 微型底栖生物的生物量转换系数表 22

ICS 07. 060
中华人民共和国海洋行业标准
HY/T140—2011
海洋微型底栖生物调查规范
Specifications for the survey of marine microbenthos2011-05-09发布
国家海洋局
2011-06-01实施
1范国
规范性引用文件
术语和定义
基本要求
主婴说测量
辅助观测盘
观测站点与层次设计
文档与图件
调查的技术要求和程浮步骤
质量计划和质量控制措施
采样和固定
避上采样
潮问带采样
活体样品来集
来样管
样品处理
5.6环境内子的测定
6活体微型底牺生物调查
力法概述
设备材料
样品分离和培养
观案和记录分折
底微藻和底栖纵幽凋杏
方法概述
7.2用丁实验室操作的荧光染色
7.3用丁船F操作的荧光染色
8底栖原生动物调查
8.1方法概述
8,2工具和试剂
8.3Percoll离心分离技术
8. 4Ludx离心分离技术
8.5定盘蛋广银染色技术..
9微型底栖生物的定性和定量分析目www.bzxz.net
TTTKNTKACA
HY/T 140—2011
HY/1 140—2011
9.1显微镜检分析
9.2常用群落参数的计
9.3填写报表·
9.4统计分析和绘图·
10调查成果内容及要求
原始记录
文档·
元数据
[0.5调查黏论
10.6成果的质量评估
附录A（规范性附录）微型底栖生物的凡个1要类群阁录B（资料性附录）微型底栖生物采样和镜检记录表附录（规范性附录）微型底栖牛物调查的儿种议器设备图附录D（规范性附录）微型底栖生物的生物量转换系数表附录（现范性附录）微型底栖生物调查的几个关键技术流程图附录F(现范性附录)
附录G（规范性附录）
参考文献
图℃1
微型旅栖生物的生物体积计算公式·各种游羧的配方和配制
微型底栖物的几个主要类群图
真空过滤系统图
滤膜筐图
底微藻和细菌萤光染色技术流程图图E.2Ptroll离心分离技术流程图…Ludox离心分离技术流释图
定蛋亡银染色(QPS)技术流程图
微型底栖生物的生物件秘计算公式图微型底栖牛物聚样记录表
微型底栖生物镜检记求表
表,1微塑底柄牛物的生物量转换系数表TTTKAONATKACA
本标谁按照（H/T1.1—2009给出的规则起草HY/T140—2011
请注意本文件的束些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的贵本标准由中国科学院海洋研究所提出本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAT心283)归口本标准起草单位：中国科学院海洋研究听，本标准主要起草人;类度立,徐全栋。E
TTKONKACA
HY/T 140—2011
本标准的制定是为广填补GB/12763.6或海洋调查规范第6部分·海浮生物调查中缺乏有关微型底栖生物调查的规定。
为了完善我国海洋调查内容，为海洋微型底栖生物调查1作提供准确、先进、实用的研究力法，实现大型、小型和微型底栖生物的系统集成研究，国家海洋局“908专项办公室”组织开展了本标准的制定本标准适用于潮间带、浅海和深海等不同生境的海洋微型底橘生物调查，对F保障，支撑调查工作的顺利开展，统一调查程序、操作要求和数据处理方法等具有重要作用。TTTKANTKACA
1范围
海洋微型底栖生物调查规范
HY/T 140—2011
本标雅确定了海洋微型底柄生物调查的基本要求.确立了采样和固定、处离和培养、离心和提取染色和制片、定性和定量分析等一般规定和方法。本标准适用于潮间带.浅海和深海等不同生境的海洋微型底牺牛物调查。2规范性引用文件
下列文件对于木文件的应用是必不可少的，凡是注月期的小用文件，仅注H期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件，GB/T12763.1海洋调查规范第1部分：总则GB/T12763.6海洋调查规范第6部分·海洋牛物调查3术语和定义
下列术语和定义适用十本文件：3.1
微型底插生物
microhcnthos
生活于沉积物表面和底内的，被心.22μm滤膜裁留的所有单细胞惊核和真核微型牛物。注l：微型底栖上物主要包括底栖细图（benthichacleria）蓝细菌（cyanobarteria），栖微藻（benthicmicroalgae）底栖原生动物底栖原生动物benthicprotozoa
生活史的全部或大部分时间与沉积物惑水体的基质相烂联的动物性单细胞真核生物注：上要包括异养鞭毛虫（heteroirophicegellae）、纤毛虫（eiline)和肉足虫（sererielimis）等4基本要求
4. 1主要现测量
测定土要微型底牺生物类群的组成、个休丰度生物量等，4.2辅助观测量
群落结构.如物种多群性、物种丰富度,均勾度指数、群落相似性等,可根据任务书或合同书、调查计划,GB/T 12763, 6 白拟。
4.3观测站点与层次设计
4.3.1观测站点包括海上采样（采芯样或潜水采样）潮间带采样。1
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4.3.2层次设计根据任务书或合同5、调查计划、GT12763.6自拟。4.4文档与图件
文档内容包括调查海区的自然环境利调查研究程度、海1调查了作、调查资料利图件的分析和解释。主要图件应标明图竹的种类，内容及其编绘方法。4.5调查的技术要求和程序步骤
4.5.1技术要求主要包括以下方而：α）海上采样从采样器敢未受扰动的沉积物芯样，末受扰动沉积物的标志是表面有一定深度的上覆水，采样器闭合严密，无任何搬漏b）海上来样宜协园大型底栖尘物和小型底栖牛物调查进行；c）个体丰度（abundance)以个每10平方米或个每立方原米表乐：l）生物量(biomass)以微克每1o力厘米的碳量或微克每立方厘米的嵌量表示：c）调查要素包括测定土要类群的组成、丰度、生物量和优势类群的种类组成4.5.2程序步骤包括采样、固定、环境闪子测定、样品定性定量分析、数据处理分析。4. 6质量计划和质量控制措施
4.6.1执行单位应撰马质量计划书：内容包括：用标和文件；调查任务概说：质量日标；执行单位组织机构及岗位职责：质量计刻保证措施。4.6.2质量措施主要包括以下方面：a）建立质量控制体系：任务执行单微除接变主管部门和技术监督机构的监督外.还应自行核对利质量检查，制定质量控制制度，明确质量控制职责和质量监督、检查程序，严格执行质量控制规楚：
h）实施全过程质挤制：下达调查任务应有明确的质量要求：对已有的文献，资料应进行具体质量分析：使用的仪器，设备、「.具、材料应符合质量标准：对海上获得的样品和资料，应有明确的现场记录海F调查结束后，应刘原始资料、样品进行核对，对样品的分析，鉴定和资料的整理、计算结果,应实事求是；文件，资料和成果归档,应符合归挡求；实行全员质量控制：调查人员应其希相关期业按能，在调查人员的职责中都应有质量要求5采样和固定
5.1海上采样
5.1.1来样器
应按GR/12763.1和GB/T12763.6的具体要求，近海采样有协同大型和小型底栖生物调查所用的设备：条作许可时，应采用沉积物多管采样器张联未受忧动的样品！深海采集所用采样群依以船舶设备配备条件。
5.1,2采芯样
宜与小型底栖生物调查同步。用采样节从未受扰动的采泥器中取芯样，依据实验要求取所需深度的沉积物，果样的位置一般离开采泥器边缘至少2 c1m1;随机取3个～~5个重复芯样。5.1.3潜水采样
条件许可时逊行游水采样，方法同GB/T127G3.6的小型底牺生物调查2
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5.2潮间带采样
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潮问带采样宜与大型底栖生物和小型底牺生物调查同步，即在选定的潮滩区，代表性断面代丧性站位（高、巾潮、低潮)架样，每站接工作篇要机采敢木受十的样品3个~~5个，5.3活体样品采集
根据调食要求且实验条件许可时进行活体样品采集。选择典型区域的采样地（如有机质车富的地带）用铲子将表层沉积物样品收集到干准无英样品瓶巾同时添加沉积物的浸出液；在盐沼杂草地带，采集沉积物样品的同时收集枯极落、树根等样品5.4采样管
内径 2. 2 cmt --8.8rm),2. 6 cm(—5. 3 cm1,3. 4 cm(- 9, 1 cr}和 3. 6 cm(—ld cm\): 参考GB/T12763.6的小型底栖牛物调查所用采样臀，对于砂质沉积物，直接将深样管捕人相应的深度：泥质或滤砂质样品，采样管插人沉积物前用胶塞封作上端：于推胶案至沉积物界面附近排除空气层：然后拍人沉积物，边插逆段上端的胶塞，使管内保持定的真空度，避免沉积物间的挤压一日采样背离底即于封下端+然从底部推归样品所进行分层切片。5.5样品处理
5.5.1固定试剂
戊一醛,酒精。
5.5.2样品分层
根据实验要求设计分层采样。 海 上采样将芯样按照 n cm～2 cl,2 etn -5 cm,3 cm ～8 rni(或5cm~10cm分层。潮间带采样按底质情况分层：砂泥质/泥砂质证积物进行0cm~2em，2cm~5cm，5 cm~8 cm或 5 cm1 ~11 em)分层:泥质/淤滤质进行0 cm ~0. 5 cm,0. 5 t:m~2 cm,2 cm~5 cm.5 ct~cm分层：砂质沉积物采样深度应参考潜水面深度设计一个分层。5.5.3样品分装
将样品分层切片后，分别装人不同样品瓶内·做好标记（晚场投标签或瓶外标记）。5.5. 4来样记录
现场应详细记录采样情况，生境情况，注意记录分层情况.心样颜色以及底质大体状况等（参见表 B, 1),
5.5.5样品固定和运输
定量样品宜使用中性冷成一醛固定，最终浓度为2完。不宜使用酸性固定液。活体样品不必阅定，装瓶后预留透气孔或呼吸空间，低温避光运回实验室。5,6环境因子的测定
应包括沉积物粒度，含水量（%），总有机碳（）,啡绿素(hl )和脱镁川绿素(Ph),用于粒度分析利有机磁分析的沉积物量应不少于50g,叶绿素a和脱镁叫绿素 a用2. 2 cm~2. 6 cm 内径的有机玻聘管取芯群2个（深度根据分甚或实验要求)，分别装人塑料封口袋后，于20℃冰箱内保存。回到3
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实验室应赶紧测定。
6活体微型底栖生物调查
6,1 方法概述
将活体微型底炳尘物连同沉积物一起采集，在实验室内通过分离、培养和孵化等方法获得活体细胞样本，利用显微镜逃行活体观察并记录，获取染色后易消失的分类学特征及活体的生态学数据。6.2设备材料
包括如下：
H）仪器设备：体桃显微镜（透射式解剖镜）、高分麟率光学显微镜、显微成像系统、紫外灯、恒温箱，生化培养箱、冰箱、尚心机等
b）工具器血:网筛(500 μm)解剖针、于、凹玻片、载敏片、盖玻片,培养血,环胎EL、滤纸、微吸，洗瓶等：
心）试剂药品;儿工林、过滤游水饵料食物（米粒、麦粒、微藻)等。6.3样品分离和培养
6.3.1分离方法
根据试验要求和沉积物的不间类型，以肢底栖原生动物类群的不同特性·分离标生物所采用的方法如下：
a）培养法：通过孵化培养使沉积物中处于活动期的底栖源生动物整殖，使非活动期的底栖源生动物（如包囊)萌发，
注1，此法宜用于研究成创囊的底栖原生动物。b）稀释法：通过逐级稀释沉积物，收集上清液，使底栖原生动物与汇积物进行分离，进行定性和定星分析；
注2：此法它用了砂质荐品的底原生动物提取，对泥质样品不宜使用c）吸管分离法：接用微吸管吸取日标生物进行定性研究；d）盖片法：在沉积物上方覆盖玻片，收集不同时间段盖破片所附着的微型生物群格：注3：此法宜旧于固若生、附若生，周丛生类群的获取，不宜用于其他生物类群的提取：e）海冰法：在沉积物上方放适量海冰，以药棉间隔，融化后的海冰流经药棉逐渐渗透到沈积物上在重力和温些的作用下，底栖原生动物逐渐移至下方温度较高的培养皿中：注4：此法宜用下砂质，略适于泥砂质的底栖原生动物提取，不宜用于泌质沉积物。f）氯化镁冲洗法：利用MgCl对底栖原牛动物的麻醉作用，以海水配制的Mgl冲洗沉积物，获得底栖原牛动物，
注5：此法宜用于砂质或泥砂质的底原生动物提取，不宜用」泥质沉积物以及用丁对化学物品敏感的生物类群。6.3.2培养方法
直接吸取野外样品人培养血巾，于解剖髋下去除多余的沉积物颗粒，添加适量的饵料（米粒、支粒、各类微藻）。通常每日检查，清除不嵌保留且繁殖过快的种类。可建文多个培养体系，营造不向的环境条件（如饵料，温度和光照等）。当粗培养达到-定的规模，对些种类可以建文纯培养，通过逐渐增加过滤海水与沉积物浸出液的比例使日标生物逐渐适应实验室条件，对于有些难以驯化的种类，官直接分离并进行实验处理。
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6.4观察和记录分析
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纤毛与的活体观察宜使用高精度微分于涉显微镜，观察纤毛排布等精细结构。有壳类肉足虫（有孔虫、充变形虫！的观案，先正解剖镜装取外形及运动特征后，于高精度光学显微镜下规察精细结构。鞭虫的观察宜使用微分干涉显微镜，重要特征应同时借助电了显微镜获最。底辆庭藻的观察一毁采用直接蒂释法在光学显微镜下观察，妞对于一些壳面花纹在光学显微镜下难以避别的硅藻种类，可通过散化处理+光学显微镜下观察如借助电子显微镜鉴定则更症。实验操作如下，用微吸普吸取虫体，置丁载玻片上；加盖玻片，四角涂凡十林，避免过度挤压虫体；先于低倍镜下观察运动特征，再置下高培镜下现察并记录详细的分类学特征；包括体色，大小，外形、细胞结构（如鞭毛，纤毛，骨架结构射出体、固者器、色素、食物泡、伸缩池及核器特征等），对于现有周定剂难以固定的微型底栖生物（如架些鞭毛虫和肉足虫），可借助下不同培养基对沉积物样品进行室内孵化，获得活体牛物后进行规察及分析折，达成对该牛物种类及数量的估计。了底橘微藻和底摘细菌调查
7.1方法概述
沉积物样品经迈当稀释后利用真穿过滤系统过滤收集到0.22uT孔径黑色滤膜（聚碳酸酯膜pcly-carbonatefilter或混合纤维素膜iixtdcelluloscestermembranefillrr】:，进行荧光染色，常用DAPI，即1,6-一滕基-2-苯基吲哚4',-dizmidio-2-pheylindolt）。染色后的底栖微藻和细菌样品终封片以后，能避光冷冻储存：个月，分析时置于荧光显微镜下进行镜检计数。7.2用于实验室操作的荧光染色
7.2.1设备和工具
包括如下：
尘物分离装置（直空过滤系统见图（1)；h）荧光显微镜：
超声波破碎仪；
涡靛混合议目
c） 平头子、滤膜、离心管(5 ml,15 mL,30 mL)。7.2.2试剂
所有溶剂（包括蒸馏水）应经0.22以叫孔径滤膜过滤，稀释所用辫剂应与沉积物原始渗透压/盐度接近。黑色亲碳酸醇膜可通过苏丹黑或伊拉克黑预染聚碳酸酯膜获得：所用试剂包括如下：
a)DAPI,6-diantidino 2-phenylindole:)或吖啶澄(Acridine arange)原液:h)
(.)lmol/L焦磷酸四钠储备铰(FPi-Natl)：苏丹黑(Sudanblack）或世拉克黑（Traqhlack）d
酒精：
黑色聚碳酸膜（0.22㎡孔径）;
碎冰。
滤膜的预染
工作序如下：
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IY/T 140—2011
a）将苏丹思或伊拉克然熙粉末用7:>%酒精配制成整浓度为2尽/1.的溶液：b将聚碳酸酯膜置十其巾卒少31h,染色消除聚碳酸酶膜的自发荧光；c）预染要求提前1大～2大进行.现用现制.建议小要长时间浸泡。7.2.4预染膜的清洗
工作程序如下：
）将预染的聚碳敲酯膜从酒精中取出,用水流急速冲洗；）将冲洗过的聚碳酸酯膜再用蒸馏水冲洗：）将黑膜浸泡于盛有蒸馏水的培养血中；山）染色时，黑膜放置于滤网时，要求光亮面朝！，用锻子取出滤膜，放置到过滤器巾，黑膜与滤器之问另放一张滤膜或筛绢作为副膜，注：在酒结中浸池的黑膜表面常附老杀质干优架色和镜检，因此水流急速冲洗十分承要。实验统果表明用新谢的白来水急速冲洗后，再用蒸溜水冲洗黑膜·不仅能够有效去除滤膜表面杂质，镜捡广黑膜附着白.米水中细菌机率很小.0。
7.2.5样品稀释和分散
工作释序如下：
）将固是后的沉积物样品用芯菌蒸留水惑颗粒薄水（0.2m普通滤膜过滤稀释，剧烈摇动混刘后，定量移液器取分样（推荐0.5mL)：b)稀释后的样品用 PPi-NaCl(最终浓度为 1 mmol/L)常温避光培育，使底栖微藻和细菌从沉积物粒表面分散：
c）砂质和泥砂质样品孵化约15min，泥质样品孵化15min30min，7.2.6超声波处理
样品4℃预冷却后离心管外围用碎冰包围，置于超市被破碎仪分散。砂质和泥沙质样品处埋180s（振幅109μm,50，6m微探头）每15*问隔破碎，冷却1min；泥贞样品处埋60s(振幅109 μm+100 W+3 mm微探头)每 30 s间隔破碎,冷却1min,7.2.7稀释淘洗
下作程序如下：
a）加蒸馏水至10mL扑洗，激烈摇晃混合：b）沉积物颗粒沉降约s.从液柱中间吸取清液(5mL)；亚复上述操作8次：
d将所有清液混合均合计40ml.).取2I.-1l.分样用于染色：e）计算稀释放人倍率（一般泌质样品较砂质及泥砂质样品所需的释倍率相对大些）.7.2.8
荧光染色
用DAPl最终浓度1g/mL5ug/mL）或吖啶橙（最终浓度10g/nl.）染色至[0in~15 min，此步骤应避光低温操作，一般放在冰箱中进行染色7. 2. 9样品过滤收集
工作程序如下：
{）将染色的样品冉次充分摇勺：6
h）利用真空过滤系统,将样品浓缩过滤到0.22um 孔径的黑案碳酸酯膜上：HY/T 140—2011
）定量样品应充分转移至滤膜上·用P1巧NI济液冲洗样品瓶数次后，过滤除去过多的染液7. 2. 10封片
工作程序如下：
）用平头镊子将滤膜取下.滴适萤去荧光香粘油或1油：蒸溜水（1：1)封片：1)封片究成后，可暂时避光冷冻保存(一个门),案件许可时赶紧镜检，7.2.11荧光镜检
在荧光显微镜放大倍率1000倍下观察计数。异养和自养微型生物类群要求分别计数.通过转换紫外光和蓝光区分、
7.2.12异养和自养微型底栖生物的区分DAII染色后-异养的微型底烟土物在紫外光激发下早现蓝色，色系型（自养)徽型成辆生物在蓝光激发卜呈现红色，吖啶橙染色后细菌在蓝色微发光下里红色（活菌)或绿色（休眠或死菌）估算生物量官将微型鞭毛虫（nanollagcllates)进行如下划分：2m养微型额毛虫：
-5rm～l0 m异养微型鞭毛出;
1020异养微塑鞭毛
---2um~5m色素型微型鞭毛出：
—5 [m~10 [m 色素型微型鞭毛出:—10 μm~20μm色素型微型鞭毛虫。7. 2. 13 计数和测量
T.作程序如下：
随机规察20个~30个视野计数乎均值；a
细菌的计数一殷每片计数约500个：鞭毛虫、硅藻和蓝细菌的计数-般每片卒少计3个-·个：d）任何样品都应进行预实验，调整合适的稀释倍率，一般以每个视野中含10个~-20个细菌为较理想的计数状态，
7. 2. 14丰度和生物量
依据每个视野的微型牛物数量，视野而积和滤膜面积比值，样品的稀释浓度以及样品的最初体积米计穿底辆抗积物中微型车物的卡使。生物虽的计算恨据微型生物体积数值,参照各类群的转换系数避行<见表1).1)。7.3用于船上操作的荧光染色
7.3.1方法概述
船上采样因风浪颠，无法使用超声波破碎仪和PPiNaCl分散。耽场固定店，直接采取人工逐级稀释法进行样品称释及分散，记录帮释倍率。见场进行荧光染色，将封片冷冻存放，封片带回实验室镜检分析。
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