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GB 15193.23-2014

基本信息

标准号: GB 15193.23-2014

中文名称:食品安全国家标准 体外哺乳细胞染色体畸变试验

标准类别:国家标准(GB)

标准状态:现行

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GB 15193.23-2014 食品安全国家标准 体外哺乳细胞染色体畸变试验 GB15193.23-2014 标准压缩包解压密码:www.bzxz.net

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标准内容

中华人民共和国国家标准
GB15193.23—2014
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞染色体畸变试验2014-12-01发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2015-05-01实施
1范围
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞染色体畸变试验本标准规定了体外哺乳类细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体畸变2术语和定义
2.1染色体结构畸变
GB15193.23—2014
通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和断片、染色体互换等。染色体结构畸变可分为染色体型畸变(chromosome-typeaberration)和染色单体型畸变(chromatid-typeaberration)。2.1.1染色体型畸变
染色体结构损伤,表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组等改变2.1.2染色单体型畸变
染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组等改变。2.2有丝分裂指数
中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值;是反映细胞增殖程度的指标。2.3核内复制
在DNA复制的S期之后,细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个S期的过程。其结果是染色体有4、8、16倍的染色单体。
2.4裂隙
染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度,为染色单体的最小错误排列。3试验目的和原理
通过检测受试物是否诱发体外培养的哺乳类细胞染色体畸变,评价受试物致突变的可能性。在加入或不加入代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳类细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙胺)处理,使细胞停止在中期分裂相,随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。4仪器和试剂
4.1仪器
细胞培养箱,倒置显微镜,超净台,离心机。1
GB15193.23—2014
4.2培养液
常用Eagle'sMEM培养液(minimumessentialmedium,MEM),也可选用其他合适培养液。加人抗菌素(青霉素按100IU/mL、链霉素100μg/mL),将灭活的胎牛血清或小牛血清按10%的比例加人培养液。
4.3代谢活化系统
4.3.1S9辅助因子的配制
4.3.1.1镁钾溶液
氯化镁1.9g和氯化钾6.15g加蒸馏水溶解至100mL。4.3.1.20.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)磷酸氢二钠(NaHPO4,28.4g/L)440mL,磷酸二氢钠(NaHPO。·HO.27.6g/L)60mL,调pH至7.4.0.103MPa20min灭菌或滤菌。4.3.1.3辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液无菌条件下称取辅酶-Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液,现用现配。4.3.1.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用蒸馏水溶解配制成0.05mol/L,过滤灭菌。现用现配。4.3.2大鼠肝S9组分的诱导和配制选健康雄性成年SD或Wistar大鼠,体重150g~200g,约5周龄~6周龄。将多氯联苯(Aroclor1254)溶于玉米油中,浓度为200g/L,按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射,5d后处死动物,处死前禁食12h
也可采用苯巴比妥钠和β-黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮,剂量均为80mg/kg体重.连续3d.禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加0.1mol/L氯化钾溶液3mL,连同烧杯移入冰浴中,用消毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min,1min2min)或组织匀浆器(低于20000r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10min,吸出上清液为S9组分分装于无菌冷冻管中,每管2mL左右,最好用液氮或干冰速冻后置一80℃低温保存。S9组分制成后.经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后存于一80℃低温或冰冻于燥,保存期不超过1年4.3.310%S9混合液的制备
一般由S9组分和辅助因子按1:9组成10%的S9混合液,无菌现用现配。10%S9混合液10mL配制如下:
取上述磷酸盐缓冲液6.0mL、镁钾溶液0.4mL、葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液1.0mL、辅酶-ⅡI溶液1.6mL、肝S9组分1.0mL,混匀.置冰浴中待用。S9混合液浓度一般为1%~10%,实际使用浓度可由各实验室自行决定,但需对其活性进行鉴定2
必须能明显活化阳性对照物,且对细胞无明显毒性秋水仙素溶液
GB15193.23—2014
用PBS溶液配制适当浓度的储备液,过滤除菌,在避光冷藏的条件下至少能保存6个月。4.50.075mol/L氯化钾溶液
5.59g氯化钾加蒸馏水至1000mL。4.6固定液
甲醇:冰醋酸为3:1.临用前配制。根据试验条件,可适当调整冰醋酸的浓度,改善染色体分散度,但不宜过天,导致细胞破裂4.7姬姆萨(Giemsa)染液
取姬姆萨染料3.8g,置乳钵中,加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375mL,待完全溶解后,再加125mL甘油,放人37℃温箱中保温48h。保温期间振摇数次,使充分溶解。取出过滤,2周后使用,作为姬姆萨染液原液。使用时,取1份姬姆萨染液原液,与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)混合,配成其应用液,现配现用。
磷酸盐缓冲液(1/15mol/L,pH6.8)配制方法如下:a)第一液:取磷酸氢二钠(Na2HPO,)9.47g溶于去离子水1000mL中,配成1/15mol/L溶液;b)第二液:取磷酸二氢钾(KHPO,)9.07g溶于去离子水1000mL中,配成1/15mol/L溶液;c)取第一液50mL加于第二液50mL中混匀,即为pH6.8的1/15mol/L磷酸盐缓冲液5试验方法
受试物
固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中,并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应无菌现用现配,否则须确认储存不影响其稳定性5.2细胞株
可选用中国仓鼠肺(CHL)细胞株或卵巢(CHO)细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞(lymphocyte)。试验前检查细胞的核型和染色体数目,检测细胞有无支原体污染。推荐使用中国仓鼠肺(CHL)细胞株。
5.3剂量
5.3.1剂量设置
受试物至少应取3个检测剂量。对有细胞毒性的受试物,其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无毒性(细胞存活率在20%~100%的范围内);通常浓度间隔系数不大于2/10。5.3.2最高剂量的选择
当收获细胞时,最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数(天于50%,如毒性过天,应适当增加接种细胞数);同时应该考虑受试物对溶解度、pH和摩尔渗透压浓度的影响;对无细胞毒性或细胞毒性很小的化合物,最高剂量应达到5uL/mL、5mg/mL或10mmol/L3
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对溶解度较低的物质,当达到最大溶解浓度时仍无毒性,则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下,应使用一个以上可见沉淀的浓度溶解性可用肉眼鉴别,但沉淀不能影响观察。
5.3.3细胞毒性的确定
测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况的指标,如相对集落形成率或相对细胞生长率等。应在S9系统存在或不存在的条件下测定细胞毒性。5.3.4阳性对照
可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物,应是已知的断裂剂,能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当不存在外源性代谢活化系统时,可使用的阳性对照物有甲磺酸甲酯(methylmethanesulphonate,MMS)、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate,EMS)、丝裂霉素C(mytomycinC)乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)、硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)等。当存在外源性活化系统时,可使的阳性对照物有苯并[a」芘[benzo(a)pyrene,BaP]、环磷酰胺(cyclophosphamide)等。
不加S9的阳性对照常用丝裂素C.其常用浓度为0.2ug/mL~0.8μg/mL。其pH为6~9的水溶液在0℃~5℃下避光保存能存放1周。加S9的阳性对照常用环磷酰胺,其常用浓度为8ug/mL~15ug/mL。其水溶液不稳定,应现配现用5.3.5阴性对照
溶媒应为非致突变物,不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。首选溶媒对照是不含血清的培养液和水,亦可使用二甲基亚砜(DMSO),但浓度不应大于0.5%。5.3.6空白对照
如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照。5.4试验步骤
5.4.1细胞培养与染毒
试验需在加入和不加人S9(S9的终浓度常为1%~10%,以细胞毒性试验结果为准)的条件下进行。试验前一天,将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中[以收获细胞时,培养血(瓶)的细胞未长满为标准,一般以长到85%左右为佳;如用CHL细胞,可接种1X10%个],放CO2培养箱内培养。试验时吸去培养血(瓶)中的培养液,加入一定浓度的受试物、S9混合液(不加S9混合液时,需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液,置培养箱中处理2h6h。处理结束后,吸去含受试物的培养液.用PBS溶液洗细胞3次,加入含10%胎牛血清的培养液,放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前2h4h,加入细胞分裂中期阻断剂(如用秋水仙素,终浓度为0.1μg/mL1μg/mL)。当受试物为单一化学物质时,如果在上述加人和不加人S9混合液的条件下均获得阴性结果,则需加做长时间处理的试验,即在没有S9混合液的条件下,使受试物与试验系统的接触时间延长至24h当难以得出明确结论时.应更换试验条件,如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。
5.4.2收获细胞与制片
5.4.2.1消化
用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞脱落后,加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋4
GB15193.23—2014
白酶的作用,混匀,放人离心管以800r/min~1000r/min的速度离心5min,弃去上清液5.4.2.2低渗
加人0.075mol/L氯化钾溶液2mL.用滴管将细胞轻轻地混匀,放入37℃细胞培养箱中低渗处理30min~40min。
5.4.2.3固定
加人2mL固定液,混勾后固定5min以上,以800r/min~1000r/min速度离心5min,弃去上清液。重复一次,弃去上清液,
5.4.2.4滴片
加人数滴新鲜固定液,混匀。用混悬液滴片,自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。5.4.2.5染色
5%~10%姬姆萨染液,15min~20min。5.4.3阅片
在油镜下阅片,每一剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相,且每个观察细胞的染色体数在2n士2范围之内。对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。5.5观察指标
5.5.1染色体数目的改变
5.5.1.1非整倍体:亚二倍体或超二倍体。5.5.1.2
多倍体:染色体成倍增加。
核内复制:核膜内的特殊形式的多倍化现象5.5.2染色体结构的改变
断裂:损伤长度大于染色体的宽度。5.5.2.2
微小体:较断片小而呈圆形。
有着丝点环:带有着丝点部分,两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。无着丝点环:成环状结构。
单体互换:形成三辐体、四辐体或多种形状的图像双微小体:成对的染色质小体
裂隙:损伤的长度小于染色单体的宽度非特定性型变化:如粉碎化、着丝点细长化、黏着等。6数据处理和结果评价
数据处理
数据按不同剂量列表,指标包括观察细胞数、畸变细胞数、染色体畸变率、各剂量组及对照组不同类型染色体畸变数与畸变率等。裂隙应单独记录和报告,但一般不计人总的畸变率。各组的染色体畸变率用%检验进行统计学处理。
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结果评价
下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果:a)受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义,并与剂量相关;b)
受试物在任何一个剂量条件下,引起的染色体结构畸变数增加具有统计学意义,并有可重复性。
7试验报告
试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。7.1
试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期,7.2
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期7.3
试验摘要。
受试物:名称、鉴定资料、CAS号(如已知)、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。
7.6溶媒:溶媒的选择依据为受试物在溶媒中的溶剂性和稳定性。7.7
细胞株:细胞株的来源、名称。7.8试验条件:剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。7.8.1代谢活化系统:制备S9所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9混合液的配方。7.8.2对照物:阳性对照物的名称、生产厂家、批号和选用浓度。7.8.3培养液:所用培养液的名称、血清类别和使用浓度。7.8.4接种的细胞密度以及所用培养皿(瓶)的规格。7.8.5中期分裂阻断剂:名称、所用浓度、作用时间。7.8.6处理时间:受试物与试验系统的接触时间。7.8.7制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法。7.9试验结果。
7.9.1试验结果应包括细胞毒性的测定、加受试物后的溶解情况及对pH和渗透压的影响(如果有影响)。bzxZ.net
7.9.2各剂量组和对照组细胞染色体畸变率。7.9.3本实验室的阳性对照组和阴性对照组(常用溶媒,如DMSO)在本实验室历史上的染色体畸变率范围和检测数(说明样品数)
7.10试验结论:给出受试物在试验条件下是否引起体外培养的细胞染色体畸变的结论,必要时对有关问题进行讨论。
8试验的解释
大部分的致突变剂导致染色单体型畸变,偶有染色体型畸变发生。虽然多倍体的增加可能预示着染色体数目畸变的可能·但本方法并不适用于检测染色体的数目畸变。阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞染色体畸变。阴性结果表明在该试验条件下受试物不引起所用哺乳类细胞染色体畸变。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。6
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