ICS11.220 B41 备案号：58552-2018 辽 宁省地 DB21 方 标准 DB21/T28262017 O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法芳棕准全产 省地 RT-LAMP detectfon mathod of the foot and mouth disease virus O typeDB21 2017-11-16发布 宁省质量技术监督局 开 2017-12-16实施 发布 前言 范围。 2规范性引用文件 3RT-LAMP 3.1材料与试剂 3.1.1仪器马器材 3.1.2试剂. 3.2抽样 3.3操作方法 目 次 DB21/T28262017 I 有商有科公公 ... 3.3.1样品的处王 3.3.2 检测 3.4结果判造 3.4.1 3.4.2 3.4.3 析条件设定 结果茶 质报 结 昊描速及判定 附录A（规芭性附录） 附录B（规范性附泵） DEPC .. ...... DB21 5 磷酸盐缓冲盐水配方 前言 本标准按照GB/斤1.1-2009给出的规则起草，本标准的附录A为资料性附录。 本标准由迁宁省畜牧兽医局提出。本标准出辽宁省畜牧兽医局归口。DB21/T28262017 本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：李井春，曹东，申贯男，梁介，张健，高志峰，李红料，赵培，印宝东，王克，有玉晟. DB21 II 1范围 O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法本标准规定了0型口蹄疫病毒RT-LAMP检测的操作方法。本标准适用于动物及其产品中0型口蹄疫病毒的快速筛查。2规范性引用文件 DB21/T28262017 下列义件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB GB/T22915口蹄疫病毒火光RTPCR检测方洗GB/T6682 3RT-LAMP 分析实验室同水 3.1材料与试剂 仪器与器材 3.1.1 DB21 时浊度分折仪或水浴锅，计时器，高速台式冷冻离心机，离心速度达12000rpm/nin以上，台式离心机，离心速度站3000rpm/min以上，混匀器，冰箱，微量可调移液器，合10ul、100u1000 L量程及配套带滤芯吸头，1.5mlEppendorf管。3.1.2试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有分装试剂均用无RNA酶污染的容器盛装，容器用DEPC水处理后高压灭菌，DEPC水配制方法见附录A。病毒总RNA提取试剂Trizol：氯仿：-20C预冷；异丙醇：-20℃C预冷：PBS：配制方法见附录B，无菌条件下加入青霉素、链覆素各10000IU/mL：75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，符合GB/T6682-2008要求，-20℃预冷：灭菌牛理盐水：DEPC水及ddH2O：RT-LAMP检测试剂盒：目视检测试剂盒： 阴性、阳性对照：阳性对照使月兰州善医研究所O型液相抗体检测试剂盒中的病毒抗原对照，阴性对照使用DEPC水： 引物：根据下载的O型FMDV保守基因区域，设计合成RT-LAMP引物，序列见表1。3.2抽样按GB/T22915方法进行 3.2.1采样工具 应配备下列采样工具：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5mLEppendorf管、研钵，以上工具必须经21土2C，15min高压灭菌井烘干。1 3.2.2样品采集 DB21/T28262017 3.2.2.1采集的样品主要为水泡皮、水泡液、血液、口腔分泌物和组织，采集后立即冷藏送检或置于含抗生素PBS的灭菌管内低温保藏，编号并作好记录。表1RT-LAMP引物及序列 引物种类 外引物 内引物 引物名称 F3 B3 FIP BIP 5 引物序列 5＇-CGTGTGGGATGTGGACTAC3 3-CGGCATTCCACCTTCAACA-3 CGTGCGGAACACTTCCTCGAACTCAGCCTTTGATGCAAACCA3'5*-TTCGGATTCCACCCGAACGCACAATGCGCTTGTTCTCGTA-33.2.2.2水泡液及水泡皮：用75%的酒精轻轻消毒水泡表皮：去掉污物后用火菌牛理盐水擦去酒精，然后用注射器穿刺水泡吸取水泡液，置十个抗入含抗生素PRS管内。编导 冷减或送检 P丽的求菌管内水泡液采取后。将水泡皮剪下，放3.2.2.3口腔分泌物和咽试子用地方标准用负增探标刮取明喉液体，放入含抗生文公 素PBS的火菌内。满号，或送 3.2.2.4 3.2.2.5 检。 3.2.3 血液：用真 空 肌肉或组织脏器： 样品购运 管或无菌注射器直接采取至无菌的FppendortDB21 冷藏或送检 或具他灭菌容碧，编号，冷藏或送样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品，放一个部料袋，保温箱中加冰、密封送实验室。 3.2.4样品制备 3.2.4.1水泡液、血液和口腔分泌液样品在混匀器上充分混合后，用高压火菌镊子将拭子中的液体挤出，空温放胃30min，取上清液转入无菌的1.5ml.Fppendorf管中，编号备用3.2.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器取检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研体中充分研磨，加10mLPBS混勾，4℃，3000rpm/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mlEppendorf管中，编号备用。3.2.5样品存放 制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融，冻融不超过3次。 3.3操作方法 3.3.1样品的处理 2