GB 5009.85-2016
基本信息
标准号： GB 5009.85-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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标准简介
GB 5009.85-2016 食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定
GB5009.85-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.85—2016
食品安全国家标准
食品中维生素B2的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.85-—2016
本标准代替GB/T5009.85—2003《食品中核黄素的测定》、GB/T9695.28—2008《肉与肉制品维生素B含量测定》、GB/T7629—2008《谷物中维生素B,测定》和GB5413.12—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定》。本标准与GB/T5009.85—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素B的测定”；一增加了高效液相色谱法；
—删除了微生物法。
1范围
食品安全国家标准
食品中维生素B2的测定
本标准规定了食品中维生素B，的测定方法。GB 5009.85—2016
本标准第一法为高效液相色谱法，第二法为荧光分光光度法，适用于各类食品中维生素B的测定第一法高效液相色谱法
2原理
试样在稀盐酸环境中恒温水解，调pH至6.0～6.5.用木瓜蛋白酶和高峰淀粉酶酶解.定容过滤后滤液经反相色谱柱分离，高效液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
盐酸（HCI)
3.1.2冰乙酸(CH,COOH)。
氢氧化钠（NaOH)。
3.1.4三水乙酸钠(CH,COONa·3H,O)。甲醇CH.OH)：色谱纯
木瓜蛋白酶：活力单位≥10U/mg。3.1.6
高峰淀粉酶：活力单位≥100U/mg.或性能相当者。试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取9mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL。3.2.2盐酸溶液（1+1)：量取100mL盐酸，缓慢倒人100mL水中，混匀3.2.3氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称取4g氢氧化钠，加90mL水溶解，冷却后定容至100ml3.2.4乙酸钠溶液（0.1mol/L）：准确称取13.60g三水乙酸钠，加900mL水溶解，用水定容至1000mL。
3.2.5乙酸钠溶液（0.05mol/L）：准确称取6.80g三水乙酸钠，加900mL水溶解，用冰乙酸调pH至4.05.0.用水定容至1000mL。
3.2.6混合酶溶液：准确称取2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解后定容至50mL。临用前配制。
3.2.7盐酸溶液（0.012mol/L）：吸取1mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL。3.3标准品
维生素B（C1H2.N,OCAS号：83-88-5）：纯度≥98%。3.4标准溶液配制
GB5009.85-—2016
3.4.1维生素B，标准储备液（100μg/mL）：将维生素B，标准品置于真空干燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后，准确称取10mg（精确至0.1mg）维生素B,标准品，加人2mL盐酸溶液（1十1)超声溶解后，立即用水转移并定容至100mL。混匀后转移人棕色玻璃容器中.在4℃冰箱中赔存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参见附录A。3.4.2维生素Bz标准中间液（2.00ug/mL）：准确吸取2.00mL维生素B标准储备液，用水稀释并定容至100mL。临用前配制。
3.4.3维生素B，标准系列工作液：分别吸取维生素Bz标准中间液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL.用水定容至10mL，该标准系列浓度分别为0.05μg/mL.0.10μg/ml0.20μg/ml、0.50μg/mL、1.00μg/ml。临用前配制。4仪器和设备
高效液相色谱仪：带荧光检测器。天平：感量为1mg和0.01mg。
高压灭菌锅。
pH计：精度0.01。
涡旋振荡器。
组织捣碎机。
恒温水浴锅。
干燥器。
分光光度计。
5分析步骤
5.1试样制备
取样品约500g，用组织捣碎机充分打匀均质，分装人洁净棕色磨口瓶中，密封，并做好标记，避光存放备用。
称取2g～10g精确至0.01g)均质后的试样（试样中维生素B，的含量大于5ug)于100mL具塞锥形瓶中，加人60mL的0.1mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞好瓶塞。将锥形瓶放人高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，冷却至室温后取出。用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0～6.5，加人2mL混合酶溶液，摇匀后·置于37.℃培养箱或恒温水浴锅中过夜酶解。将酶解液转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤或离心，取滤液或上清液，过0.45um水相滤膜作为待测液注：操作过程应避免强光照射。不加试样，按同一操作方法做空白试验。5.2仪器参考条件
a）色谱柱：Cls柱，柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm，或相当者；2
流动相：乙酸钠溶液（0.05mol/L）-甲醇（65：35）；b)
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：激发波长462nm，发射波长522nm；进样体积：20μL。
标准曲线的制作
GB5009.85—2016
将标准系列工作液分别注人高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中维生素B，的浓度。
空白试验要求
空白试验溶液色谱图中应不含待测组分峰或其他干扰峰。5分析结果的表述
试样中维生素B的含量按式(1)计算：X=-exv
式中：
试样中维生素B，（以核黄素计）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；.（1)
根据标准曲线计算得到的试样中维生素B，的浓度，单位为微克每毫升（μug/mL）)；试样溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL)；试样质量，单位为克（g）；
换算为100克样品中含量的换算系数；-将浓度单位μg/mL换算为mg/mL的换算系数。结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。其他
当取样量为10.00g时，方法检出限为0.02mg/100g，定量限为0.05mg/100g。3
9原理
荧光分光光度法
第二法
GB5009.85—2016
维生素B，在440nm～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与维生素B，的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入连二亚硫酸钠，将维生素Bz还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为试样中维生素B，所产生的荧光强度。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
盐酸（HCI)。
冰乙酸（CH.COOH)。
氢氧化钠NaOH）。
三水乙酸钠（CH.COONa·3H,O)。木瓜蛋白酶：活力单位≥10U/mg。高峰淀粉酶：活力单位≥100U/mg，或性能相当者。硅镁吸附剂：50μm~150μm。
丙酮(CH,COCH）。
高锰酸钾（KMnO）。
过氧化氢（H，O）：30%。bzxZ.net
连二亚硫酸钠（NazS2O4)。
试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取9mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL。盐酸溶液（1+1)：量取100mL盐酸，缓慢倒入100mL水中，混匀。乙酸钠溶液（0.1mol/L）：准确称取13.60g三水乙酸钠.加900mL水溶解，用水定容至1000mL。
氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称取4g氢氧化钠，加90mL水溶解，冷却后定容至100mL。10.2.4
混合酶溶液：准确称取2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解后定容至50mL。10.2.5
临用前配制。
5洗脱液：丙酮-冰乙酸-水（5十2+9.体积比）。10.2.7
高锰酸钾溶液（30g/L）：准确称取3g高锰酸钾，用水溶解后定容至100mL。3过氧化氢溶液（3%）：吸取10mL30%过氧化氢，用水稀释并定容至100mL，10.2.8
连二亚硫酸钠溶液（200g/L）：准确称取20g连二亚硫酸钠，用水溶解后定容至100mL。此溶液用前配制，保存在冰水浴中，4h内有效10.3标准品
维生素Bz（C1H2aN,O，CAS号：83-88-5)：纯度≥98%。4
10.4标准溶液配制
GB5009.85—2016
10.4.1维生素B,标准储备液（100μg/mL)：将维生素B，标准品置于真空于燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后，准确称取10mg（精确至0.1mg）维生素Bz标准品，加人2mL盐酸溶液（1十1)超声溶解后，立即用水转移并定容至100mL。混勾后转移人棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参见附录A。10.4.2维生素B，标准中间液（10pμg/mL）：准确吸取10mL维生素Bz标准储备液，用水稀释并定容至100mL。在4℃冰箱中避光贮存，保存期1个月10.4.3维生素B，标准使用溶液（1μg/mL）：准确吸取10mL维生素Bz标准中间液，用水定容至100mL。此溶液每毫升相当于1.00μg维生素Bz。在4℃冰箱中避光贮存，保存期1周。11
仪器和设备
荧光分光光度计。
11.2天平：感量为1mg和0.01mg。11.3
高压灭菌锅
11.4pH计：精度0.01。
涡旋振荡器。
组织捣碎机。
恒温水浴锅。
干燥器。
维生素Bz吸附柱。
分析步骤
12.1试样制备
12.1.1试样的水解
取样品约500g，用组织捣碎机充分打匀均质，分装人洁净棕色磨口瓶中，密封，并做好标记，避光存放备用。
称取2g~10g（精确至0.01g，约含10μg~200uμg维生素B,）均质后的试样于100mL具塞锥形瓶中，加入60mL0.1mol/L的盐酸溶液，充分摇匀，塞好瓶塞。将锥形瓶放人高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，冷却至室温后取出。用氢氧化钠溶液调pH至6.0～6.5。12.1.2试样的酶解
加人2mL混合酶溶液，摇匀后，置于37℃培养箱或恒温水浴锅中过夜酶解12.1.3过滤
将上述酶解液转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用干滤纸过滤备用。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
注：操作过程应避免强光照射。12.2氧化去杂质
视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液（约含1ug～10ug维生素B）及维生素B标准5
GB 5009.85—2016
使用溶液分别置于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰乙酸，混匀。加0.5mL30g/L高锰酸钾溶液，摇匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3%过氧化氢溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色褪去。剧烈振摇试管，使多余的氧气逸出。12.3维生素B2的吸附和洗脱
12.3.1维生素B吸附柱
硅镁吸附剂约1g用湿法装人柱，占柱长1/2～2/3（约5cm）为宜（吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上），勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min注：可使用等效商品柱。
过柱与洗脱
将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后.用约20mL热水淋洗样液中的杂质。然后用5ml洗脱液将试样中维生素B2洗脱至10mL容量瓶中，再用3mL4mL水洗吸附柱，洗出液合并至容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀后待测定。12.4标准曲线的制备
分别精确吸取维生素Bz标准使用液0.3mL0.6mL、0.9mL、1.25mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL（相当于0.3μg、0.6μg、0.9μg、1.25μg、2.5μg、5.0μg、10.0ug、20.0ug维生素B,）或取与试样含量相近的单点标准按12.2和12.3操作。12.5试样溶液的测定
于激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量试样管及标准管的荧光值。待试样管及标准管的荧光值测量后，在各管的剩余液（约5mL～7mL）中加0.1mL20%连二亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20内测出各管的荧光值，作各自的空白值。3分析结果的表述
试样中维生素B的含量按式（2）计算：X
式中：
(A-B)×S
(C-D)Xm
试样中维生素B（以核黄素计）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样管的荧光值；
试样管空白荧光值；
标准管中维生素Bz的质量，单位为微克（μg)；标准管的荧光值；
标准管空白荧光值；
试样质量，单位为克（g）；
稀释倍数：
换算为100克样品中含量的换算系数；将浓度单位μg/100g换算为mg/100g的换算系数计算结果保留至小数点后两位。..（2)
14精密度
GB5009.852016
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。其他
当取样量为10.00g时，方法检出限为0.006mg/100g，定量限为0.02mg/100g。A.1标准校正溶液的配制
附录A
维生素B2标准溶液的浓度校正方法GB5009.85—2016
准确吸取1.00mL维生素B，标准储备液，加1.30mL0.1mol/L的乙酸钠溶液，用水定容到10mL，作为标准测试液。
A.2对照溶液的配制
准确吸取1.00mL0.012mol/L的盐酸溶液，加1.30mL0.1mol/L的乙酸钠溶液，用水定容到10mL，作为对照溶液。
吸收值的测定
用1cm比色杯于444nm波长下，以对照溶液为空白对照，测定标准校正溶液的吸收值A.4标准溶液的浓度计算
标准储备液的质量浓度按式（A.1）计算：AmX10X10
式中：
标准储备液的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)：标准测试液在444nm波长下的吸光度值；A
将1%的标准溶液浓度单位换算为测定溶液浓度单位（μg/mL)的换算系数；10
标准储备液的稀释因子；
..(A.1)
维生素B，在444nm波长下的百分吸光系数E1m，即在444nm波长下，液层厚度为1cm时.浓度为1%的维生素Bz溶液（盐酸-乙酸钠溶液，pH=3.8)的吸光度，8
附录B
维生素B2的液相色谱图
维生素B,标准溶液的液相色谱图见图B.1、10. 00
维生素B2标准溶液的液相色谱图8. 00
GB5009.85—2016
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食品安全国家标准
食品中维生素B2的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.85-—2016
本标准代替GB/T5009.85—2003《食品中核黄素的测定》、GB/T9695.28—2008《肉与肉制品维生素B含量测定》、GB/T7629—2008《谷物中维生素B,测定》和GB5413.12—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定》。本标准与GB/T5009.85—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素B的测定”；一增加了高效液相色谱法；
—删除了微生物法。
1范围
食品安全国家标准
食品中维生素B2的测定
本标准规定了食品中维生素B，的测定方法。GB 5009.85—2016
本标准第一法为高效液相色谱法，第二法为荧光分光光度法，适用于各类食品中维生素B的测定第一法高效液相色谱法
2原理
试样在稀盐酸环境中恒温水解，调pH至6.0～6.5.用木瓜蛋白酶和高峰淀粉酶酶解.定容过滤后滤液经反相色谱柱分离，高效液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
盐酸（HCI)
3.1.2冰乙酸(CH,COOH)。
氢氧化钠（NaOH)。
3.1.4三水乙酸钠(CH,COONa·3H,O)。甲醇CH.OH)：色谱纯
木瓜蛋白酶：活力单位≥10U/mg。3.1.6
高峰淀粉酶：活力单位≥100U/mg.或性能相当者。试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取9mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL。3.2.2盐酸溶液（1+1)：量取100mL盐酸，缓慢倒人100mL水中，混匀3.2.3氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称取4g氢氧化钠，加90mL水溶解，冷却后定容至100ml3.2.4乙酸钠溶液（0.1mol/L）：准确称取13.60g三水乙酸钠，加900mL水溶解，用水定容至1000mL。
3.2.5乙酸钠溶液（0.05mol/L）：准确称取6.80g三水乙酸钠，加900mL水溶解，用冰乙酸调pH至4.05.0.用水定容至1000mL。
3.2.6混合酶溶液：准确称取2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解后定容至50mL。临用前配制。
3.2.7盐酸溶液（0.012mol/L）：吸取1mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL。3.3标准品
维生素B（C1H2.N,OCAS号：83-88-5）：纯度≥98%。3.4标准溶液配制
GB5009.85-—2016
3.4.1维生素B，标准储备液（100μg/mL）：将维生素B，标准品置于真空干燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后，准确称取10mg（精确至0.1mg）维生素B,标准品，加人2mL盐酸溶液（1十1)超声溶解后，立即用水转移并定容至100mL。混匀后转移人棕色玻璃容器中.在4℃冰箱中赔存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参见附录A。3.4.2维生素Bz标准中间液（2.00ug/mL）：准确吸取2.00mL维生素B标准储备液，用水稀释并定容至100mL。临用前配制。
3.4.3维生素B，标准系列工作液：分别吸取维生素Bz标准中间液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL.用水定容至10mL，该标准系列浓度分别为0.05μg/mL.0.10μg/ml0.20μg/ml、0.50μg/mL、1.00μg/ml。临用前配制。4仪器和设备
高效液相色谱仪：带荧光检测器。天平：感量为1mg和0.01mg。
高压灭菌锅。
pH计：精度0.01。
涡旋振荡器。
组织捣碎机。
恒温水浴锅。
干燥器。
分光光度计。
5分析步骤
5.1试样制备
取样品约500g，用组织捣碎机充分打匀均质，分装人洁净棕色磨口瓶中，密封，并做好标记，避光存放备用。
称取2g～10g精确至0.01g)均质后的试样（试样中维生素B，的含量大于5ug)于100mL具塞锥形瓶中，加人60mL的0.1mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞好瓶塞。将锥形瓶放人高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，冷却至室温后取出。用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0～6.5，加人2mL混合酶溶液，摇匀后·置于37.℃培养箱或恒温水浴锅中过夜酶解。将酶解液转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤或离心，取滤液或上清液，过0.45um水相滤膜作为待测液注：操作过程应避免强光照射。不加试样，按同一操作方法做空白试验。5.2仪器参考条件
a）色谱柱：Cls柱，柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm，或相当者；2
流动相：乙酸钠溶液（0.05mol/L）-甲醇（65：35）；b)
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：激发波长462nm，发射波长522nm；进样体积：20μL。
标准曲线的制作
GB5009.85—2016
将标准系列工作液分别注人高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中维生素B，的浓度。
空白试验要求
空白试验溶液色谱图中应不含待测组分峰或其他干扰峰。5分析结果的表述
试样中维生素B的含量按式(1)计算：X=-exv
式中：
试样中维生素B，（以核黄素计）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；.（1)
根据标准曲线计算得到的试样中维生素B，的浓度，单位为微克每毫升（μug/mL）)；试样溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL)；试样质量，单位为克（g）；
换算为100克样品中含量的换算系数；-将浓度单位μg/mL换算为mg/mL的换算系数。结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。其他
当取样量为10.00g时，方法检出限为0.02mg/100g，定量限为0.05mg/100g。3
9原理
荧光分光光度法
第二法
GB5009.85—2016
维生素B，在440nm～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与维生素B，的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入连二亚硫酸钠，将维生素Bz还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为试样中维生素B，所产生的荧光强度。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
盐酸（HCI)。
冰乙酸（CH.COOH)。
氢氧化钠NaOH）。
三水乙酸钠（CH.COONa·3H,O)。木瓜蛋白酶：活力单位≥10U/mg。高峰淀粉酶：活力单位≥100U/mg，或性能相当者。硅镁吸附剂：50μm~150μm。
丙酮(CH,COCH）。
高锰酸钾（KMnO）。
过氧化氢（H，O）：30%。bzxZ.net
连二亚硫酸钠（NazS2O4)。
试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取9mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL。盐酸溶液（1+1)：量取100mL盐酸，缓慢倒入100mL水中，混匀。乙酸钠溶液（0.1mol/L）：准确称取13.60g三水乙酸钠.加900mL水溶解，用水定容至1000mL。
氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称取4g氢氧化钠，加90mL水溶解，冷却后定容至100mL。10.2.4
混合酶溶液：准确称取2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解后定容至50mL。10.2.5
临用前配制。
5洗脱液：丙酮-冰乙酸-水（5十2+9.体积比）。10.2.7
高锰酸钾溶液（30g/L）：准确称取3g高锰酸钾，用水溶解后定容至100mL。3过氧化氢溶液（3%）：吸取10mL30%过氧化氢，用水稀释并定容至100mL，10.2.8
连二亚硫酸钠溶液（200g/L）：准确称取20g连二亚硫酸钠，用水溶解后定容至100mL。此溶液用前配制，保存在冰水浴中，4h内有效10.3标准品
维生素Bz（C1H2aN,O，CAS号：83-88-5)：纯度≥98%。4
10.4标准溶液配制
GB5009.85—2016
10.4.1维生素B,标准储备液（100μg/mL)：将维生素B，标准品置于真空于燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后，准确称取10mg（精确至0.1mg）维生素Bz标准品，加人2mL盐酸溶液（1十1)超声溶解后，立即用水转移并定容至100mL。混勾后转移人棕色玻璃容器中，在4℃冰箱中贮存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参见附录A。10.4.2维生素B，标准中间液（10pμg/mL）：准确吸取10mL维生素Bz标准储备液，用水稀释并定容至100mL。在4℃冰箱中避光贮存，保存期1个月10.4.3维生素B，标准使用溶液（1μg/mL）：准确吸取10mL维生素Bz标准中间液，用水定容至100mL。此溶液每毫升相当于1.00μg维生素Bz。在4℃冰箱中避光贮存，保存期1周。11
仪器和设备
荧光分光光度计。
11.2天平：感量为1mg和0.01mg。11.3
高压灭菌锅
11.4pH计：精度0.01。
涡旋振荡器。
组织捣碎机。
恒温水浴锅。
干燥器。
维生素Bz吸附柱。
分析步骤
12.1试样制备
12.1.1试样的水解
取样品约500g，用组织捣碎机充分打匀均质，分装人洁净棕色磨口瓶中，密封，并做好标记，避光存放备用。
称取2g~10g（精确至0.01g，约含10μg~200uμg维生素B,）均质后的试样于100mL具塞锥形瓶中，加入60mL0.1mol/L的盐酸溶液，充分摇匀，塞好瓶塞。将锥形瓶放人高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，冷却至室温后取出。用氢氧化钠溶液调pH至6.0～6.5。12.1.2试样的酶解
加人2mL混合酶溶液，摇匀后，置于37℃培养箱或恒温水浴锅中过夜酶解12.1.3过滤
将上述酶解液转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用干滤纸过滤备用。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
注：操作过程应避免强光照射。12.2氧化去杂质
视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液（约含1ug～10ug维生素B）及维生素B标准5
GB 5009.85—2016
使用溶液分别置于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰乙酸，混匀。加0.5mL30g/L高锰酸钾溶液，摇匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3%过氧化氢溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色褪去。剧烈振摇试管，使多余的氧气逸出。12.3维生素B2的吸附和洗脱
12.3.1维生素B吸附柱
硅镁吸附剂约1g用湿法装人柱，占柱长1/2～2/3（约5cm）为宜（吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上），勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min注：可使用等效商品柱。
过柱与洗脱
将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后.用约20mL热水淋洗样液中的杂质。然后用5ml洗脱液将试样中维生素B2洗脱至10mL容量瓶中，再用3mL4mL水洗吸附柱，洗出液合并至容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀后待测定。12.4标准曲线的制备
分别精确吸取维生素Bz标准使用液0.3mL0.6mL、0.9mL、1.25mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL（相当于0.3μg、0.6μg、0.9μg、1.25μg、2.5μg、5.0μg、10.0ug、20.0ug维生素B,）或取与试样含量相近的单点标准按12.2和12.3操作。12.5试样溶液的测定
于激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量试样管及标准管的荧光值。待试样管及标准管的荧光值测量后，在各管的剩余液（约5mL～7mL）中加0.1mL20%连二亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20内测出各管的荧光值，作各自的空白值。3分析结果的表述
试样中维生素B的含量按式（2）计算：X
式中：
(A-B)×S
(C-D)Xm
试样中维生素B（以核黄素计）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样管的荧光值；
试样管空白荧光值；
标准管中维生素Bz的质量，单位为微克（μg)；标准管的荧光值；
标准管空白荧光值；
试样质量，单位为克（g）；
稀释倍数：
换算为100克样品中含量的换算系数；将浓度单位μg/100g换算为mg/100g的换算系数计算结果保留至小数点后两位。..（2)
14精密度
GB5009.852016
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。其他
当取样量为10.00g时，方法检出限为0.006mg/100g，定量限为0.02mg/100g。A.1标准校正溶液的配制
附录A
维生素B2标准溶液的浓度校正方法GB5009.85—2016
准确吸取1.00mL维生素B，标准储备液，加1.30mL0.1mol/L的乙酸钠溶液，用水定容到10mL，作为标准测试液。
A.2对照溶液的配制
准确吸取1.00mL0.012mol/L的盐酸溶液，加1.30mL0.1mol/L的乙酸钠溶液，用水定容到10mL，作为对照溶液。
吸收值的测定
用1cm比色杯于444nm波长下，以对照溶液为空白对照，测定标准校正溶液的吸收值A.4标准溶液的浓度计算
标准储备液的质量浓度按式（A.1）计算：AmX10X10
式中：
标准储备液的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)：标准测试液在444nm波长下的吸光度值；A
将1%的标准溶液浓度单位换算为测定溶液浓度单位（μg/mL)的换算系数；10
标准储备液的稀释因子；
..(A.1)
维生素B，在444nm波长下的百分吸光系数E1m，即在444nm波长下，液层厚度为1cm时.浓度为1%的维生素Bz溶液（盐酸-乙酸钠溶液，pH=3.8)的吸光度，8
附录B
维生素B2的液相色谱图
维生素B,标准溶液的液相色谱图见图B.1、10. 00
维生素B2标准溶液的液相色谱图8. 00
GB5009.85—2016
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