GB 5009.86-2016 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定 GB5009.86-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.86—2016
食品安全国家标准
食品中抗坏血酸的测定
2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
GB5009.86—2016
本标准代替GB/T5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯耕法）》、GB/T5009.1592003《食品中还原型抗坏血酸的测定》和GB6195—1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法（2,6-二氯靛酚滴定法）》。本标准与GB/T5009.86—2003相比，主要变化如下：—一标准名称修改为“食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定”；一扩大了方法的适用范围；
一增加了高效液相色谱法及相关方法的定量限；删除了2，4-二硝基苯肼法；
增加了2.6-二氯靛酚滴定法；
—按照GB/T20001.4—2015对原标准的结构进行了修改。I
1范围
食品安全国家标准
食品中抗坏血酸的测定
GB5009.86—2016
本标准规定了高效液相色谱法、荧光法、2，6-二氯靛酚滴定法测定食品中抗坏血酸的方法本标准第一法适用于乳粉、谷物、蔬菜、水果及其制品、肉制品、维生素类补充剂、果冻、胶基糖果、八宝粥、葡萄酒中的L（十)-抗坏血酸、D(十)-抗坏血酸和L（十）-抗坏血酸总量的测定。第二法适用于乳粉、蔬菜、水果及其制品中L（十）-抗坏血酸总量的测定。第三法适用于水果、蔬菜及其制品中L（+）-抗坏血酸的测定
2术语和定义
抗坏血酸：一种具有抗氧化性质的有机化合物。又称为\维生素C”，是人体必需的营养素之一。2.1
2.2L（十）-抗坏血酸：左式右旋光抗坏血酸。具有强还原性，对人体具有生物活性。2.3D(十)-抗坏血酸：又称异抗坏血酸。具有强还原性，但对人体基本无生物活性。2.4L（十）-脱氢抗坏血酸：L（十）-抗坏血酸极易被氧化为L（十）-脱氢抗环血酸，L（十）-脱氢抗坏血酸亦可被还原为L（干)-抗坏血酸。通常称为脱氢抗坏血酸，5L（+）-抗坏血酸总量：将试样中L（+）-脱氢抗坏血酸还原成的L（+)-抗坏血酸或将试样中2.5
L(十)-抗坏血酸氧化成的L(十)-脱氢抗坏血酸后测得的L（+)-抗坏血酸总量第一法高效液相色谱法
3原理
试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后，以离子对试剂为流动相，经反相色谱柱分离，其中L（十）-抗坏血酸和D（十）-抗环血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪（波长245nm）测定；试样中的L（十）-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后，用紫外检测器（波长245nm）测定L（十）-抗坏血酸总量，或减去原样品中测得的L（十）-抗坏血酸含量而获得L（十）-脱氢抗坏血酸的含量。以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。4试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1试剂
4.1.1偏磷酸（HPO）：含量（以HPO计）38%。4.1.2磷酸三钠（NaPO.·12H,O)。4.1.3磷酸二氢钾（KH,PO,）。
4.1.4磷酸(H，PO):85%。
4.1.5L-半胱氨酸（C.H,NO,S)：优级纯。4.1.6十六烷基三甲基溴化铵（C1H2BrN)：色谱纯，甲醇（CHOH)：色谱纯。
4.2试剂配制
GB 5009.86—2016
偏磷酸溶液（200g/L）：称取200g（精确至0.1g）偏磷酸（4.1.1)，溶于水并稀释至1L.此溶液保4.2.1
存于4℃的环境下可保存一个月。4.2.2偏磷酸溶液（20g/L）：量取50mL200g/L偏磷酸溶液，用水稀释至500mL4.2.3磷酸三钠溶液（100g/L）：称取100g（精确至0.1g）磷酸三钠，溶于水并稀释至1L4.2.4L-半胱氨酸溶液（40g/L）：称取4gL-半胱氨酸，溶于水并稀释至100mL。临用时配制。4.3
标准品
L（十）-抗坏血酸标准品（CH.O，）：纯度≥99%。4.3.2D+）-抗坏血酸（异抗坏血酸）标准品（CgH.O。）：纯度≥99%。4.4
标准溶液配制
4.4.1L（+）-抗坏血酸标准贮备溶液（1.000mg/mL)：准确称取L（+）-抗坏血酸标准品0.01g（精确至0.01mg），用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周4.4.2D（十）-抗坏血酸标准贮备溶液（1.000mg/mL）：准确称取D（+）-抗坏血酸标准品0.01g（精确至0.01mg），用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2℃～8℃避光条件下可保存一周。4.4.3抗坏血酸混合标准系列工作液：分别吸取L（+）-抗坏血酸和D（+）-抗坏血酸标准贮备液0mL，0.05mL0.50mL，1.0mL，2.5mL，5.0mL，用20g/L的偏磷酸溶液定容至100mL。标准系列工作液中L（+）-抗坏血酸和D（+）-抗坏血酸的浓度分别为0μg/mL、0.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL。临用时配制。5仪器和设备
液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。5.2pH计：精度为0.01。
天平：感量为0.1g、1mg、0.01mg5.4
超声波清洗器。
离心机：转速≥4000r/min。
5.6均质机。
滤膜：0.45um水相膜
振荡器。
6分析步骤
整个检测过程尽可能在避光条件下进行。6.1试样制备
6.1.1液体或固体粉末样品：混合均匀后，应立即用于检测。2
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6.1.2水果、蔬菜及其制品或其他固体样品：取100g左右样品加人等质量20g/L的偏磷酸溶液，经均质机均质并混合均匀后，应立即测定6.2试样溶液的制备
称取相对于样品约0.5g～2g（精确至0.001g）混合均勾的固体试样或匀浆试样，或吸取2mL~10mL液体试样[使所取试样含L（+）-抗坏血酸约0.03mg～6mg]于50mL烧杯中，用20g/L的偏磷酸溶液（4.2.2）将试样转移至50ml容量瓶中，震摇溶解并定容。摇匀，全部转移至50mL离心管中，超声提取5min后，于4000r/min离心5min，取上清液过0.45μm水相滤膜，滤液待测[由此试液可同时分别测定试样中L（十）-抗坏血酸和D（+）-抗坏血酸的含量]。6.3试样溶液的还原
准确吸取20mL上述离心后的上清液于50mL离心管中，加人10mL40g/L的L-半胱氨酸溶液（4.2.4），用100g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2，以200次/min振荡5min。再用磷酸调节pH至2.5~2.8，用水将试液全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45um水相滤膜后待测由此试液可测定试样中包括脱氢型的L（十）-抗坏血酸总量」。若试样含有增稠剂，可准确吸取4mL经L-半胱氨酸溶液还原的试液，再准确加入1mL甲醇，混匀后过0.45um滤膜后待测。
6.4仪器参考条件
6.4.1色谱柱：C1s柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或同等性能的色谱柱。6.4.2检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器6.4.3流动相：A：6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵，用水溶解并定容至1L（用磷酸调pH至2.5~2.8）；B：100%甲醇。按A：B=98：2混合，过0.45μm滤膜，超声脱气。6.4.4流速：0.7mL/min。
6.4.5检测波长：245nm。
6.4.6柱温：25℃。
6.4.7进样量：20μL。
6.5标准曲线制作
分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定，以L（十)-抗坏血酸[或D（+)-抗坏血酸]标准溶液的质量浓度（μg/mL)为横坐标,L（十）-抗坏血酸[或D（十）-抗坏血酸］的峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。L（十）-抗坏血酸、D（+)-抗坏血酸标准色谱图参见附录A中图A.1。6.6试样溶液的测定
对试样溶液进行测定，根据标准曲线得到测定液中L（十）-抗坏血酸［或D（十）-抗坏血酸的浓度(μg/mL)。
6.7空白试验
空白试验系指除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量，进行平行操作7分析结果的表述
试样中L（十）-抗坏血酸[或D（+）-抗坏血酸］的含量和L（十）-抗坏血酸总量以毫克每百克表示，3
按式（1)计算：
式中：
X=(ci-c0)×V
mX1000
XFXKX100
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试样中L（十)-抗坏血酸[或D（+)-抗坏血酸、L（十)-抗坏血酸总量的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；
样液中L（+）-抗坏血酸[或D（+）-抗坏血酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；样品空白液中L（十）-抗坏血酸或D（十）-抗坏血酸的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）；实际检测试样质量，单位克（g）；1000—#
换算系数（由ug/mL换算成mg/mL的换算因子）；F
稀释倍数（若使用6.3还原步骤时，即为2.5）；若使用6.3中甲醇沉淀步骤时，即为1.25；换算系数（由mg/g换算成mg/100g的换算因子）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度wwW.bzxz.Net
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9其他
固体样品取样量为2g时.L（十）-抗坏血酸和D（十）-抗坏血酸的检出限均为0.5mg/100g，定量限均为2.0mg/100g。液体样品取样量为10g（或10mL)时，L（+）-抗坏血酸和D（+）-抗坏血酸的检出限均为0.1mg/100g（或0.1mg/100mL），定量限均为0.4mg/100g（或0.4mg/100mL）。第二法荧光法
10原理
试样中L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(十)-脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA)反应生成有荧光的喹唔啉（quinoxaline），其荧光强度与L（+）-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定试样中L（十)-抗坏血酸总量。
注：L（十）脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰11试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水11.1试剂
偏磷酸（HPO，）：含量（以HPO，计）≥38%。11.1.1
冰乙酸（CH.COOH)：浓度约为30%。4
硫酸（H.SO,）：浓度约为98%。乙酸钠（CHCOONa)。
硼酸（H,BO3)。
邻苯二胺（C,H.N，）。
百里酚蓝（C2HaoO,S)。
活性炭粉。
11.2试剂的配制
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偏磷酸-乙酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL。于4℃冰箱可保存7d～10d。11.2.2
硫酸溶液（0.15mol/L）：取8.3mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1000mL。11.2.3偏磷酸-乙酸-硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加人40mL冰乙酸，滴加0.15mol/L硫酸溶液至溶解，并稀释至500mL。
11.2.4乙酸钠溶液（500g/L）：称取500g乙酸钠，加水至1000mL。11.2.5
硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL。临用时配制。邻苯二胺溶液（200mg/L）：称取20mg邻苯二胺.用水溶解并稀释至100mL临用时配制。酸性活性炭：称取约200g活性炭粉（75μm～177μm）.加人1L盐酸（1+9).加热回流1h～2h，11.2.7
过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110℃～120℃烘箱中干燥10h，备用。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴人，如有铁离子则产生蓝色沉淀11.2.8百里酚蓝指示剂溶液（0.4mg/mL）：称取0.1g百里酚蓝，加人0.02mol/L氢氧化钠溶液约10.75mL，在玻璃研钵中研磨至溶解，用水稀释至250mL。（变色范围：pH等于1.2时呈红色：pH等于2.8时呈黄色：pH大于4时呈蓝色）。11.3标准品
L（+）-抗坏血酸标准品（C.H.O）：纯度≥99%。11.4标准品的配制
11.4.1L（+)-抗坏血酸标准溶液（1.000mg/mL）：称取L（+）-抗坏血酸0.05g（精确至0.01mg）用偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀释至50mL，该贮备液在2℃～8℃避光条件下可保存一周11.4.2L（+）-抗坏血酸标准工作液（100.0μg/mL）：准确吸取L（+）-抗坏血酸标准液10mL,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL，临用时配制。2
仪器和设备
荧光分光光度计：具有激发波长338nm及发射波长420nm。配有1cm比色血。13分析步骤
整个检测过程应在避光条件下进行13.1试液的制备
称取约100g（精确至0.1g）试样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒人捣碎机内打成匀浆，用百里酚蓝5
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指示剂测试匀浆的酸碱度。如呈红色，即称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸溶液稀释；若呈黄色或蓝色，则称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取用量根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样液中抗坏血酸含量在40μg/mL~100μg/mL之间，一般称取20g（精确至0.01g）匀浆，用相应溶液稀释至100mL.过滤，滤液备用。13.2测定
13.2.1氧化处理：分别准确吸取50mL试样滤液及抗坏血酸标准工作液于200mL具塞锥形瓶中，加人2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即为试样氧化液和标准氧化液，待测定。
13.2.2分别准确吸取10mL试样氧化液于两个100mL容量瓶中，作为\试样液”和试样空白液”。13.2.3分别准确吸取10mL标准氧化液于两个100mL容量瓶中.作为\标准液”和“标准空白液”。13.2.4于\试样空白液”和\标准空白液”中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4℃冰箱中放置2h~3h取出待测。13.2.5于“试样液”和标准液”中各加5mL的500g/L乙酸钠溶液，用水稀释至100mL，待测13.3标准曲线的制备
准确吸取上述\标准液\[L（+）-抗坏血酸含量10μg/mLJ0.5mL，1.0ml，1.5mL2.0mL，分别置于10mL具塞刻度试管中，用水补充至2.0mL。另准确吸取\标准空白液”2mL于10mL带盖刻度试管中。在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度。以\标准液”系列荧光强度分别减去“标准空白液”荧光强度的差值为纵坐标，对应的L（十）-抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或计算直线回归方程。13.4试样测定
分别准确吸取2mL\试样液”和“试样空白液”于10mL具塞刻度试管中，在暗室迅速向各管中加人5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度。以“试样液”荧光强度减去“试样空白液”的荧光强度的差值于标准曲线上查得或回归方程计算测定试样溶液中L(+)-抗坏血酸总量。14
结果计算
试样中L（十）-抗坏血酸总量，结果以毫克每百克表示，按式（2)计算：X-CXV
×F×1000
式中：
试样中L（+）-抗坏血酸的总量，单位为毫克每百克（mg/100g）；..（2)
由标准曲线查得或回归方程计算的进样液中L（十）-抗坏血酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
一一荧光反应所用试样体积，单位为毫升（mL）：实际检测试样质量，单位克（g）；试样溶液的稀释倍数；
换算系数；
换算系数，
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。6
5精密度
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在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。16其他
当样品取样量为10g时，L（+）-抗坏血酸总量的检出限为0.044mg/100g.定量限为0.7mg100g
第三法2.6-二氯靛酚滴定法
17原理
用蓝色的碱性染料2.6-二氯靛酚标准溶液对含L（十）-抗坏血酸的试样酸性浸出液进行氧化还原滴定，2.6-二氯靛酚被还原为无色，当到达滴定终点时，多余的2.6-二氯靛酚在酸性介质中显浅红色，由2.6-二氯靛酚的消耗量计算样品中L（十）-抗坏血酸的含量18
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水18.1试剂
偏磷酸（HPO：），：含量（以HPO：计）≥38%。草酸(C,H204)。
碳酸氢钠（NaHCO）
2,6-二氯靛酚（2,6-二氯靛酚钠盐，C12H.Cl2NNaO,）。白陶土（或高岭土)：对抗坏血酸无吸附性。18.2试剂的配制
偏磷酸溶液（20g/L）：称取20g偏磷酸，用水溶解并定容至1L。草酸溶液（20g/L）：称取20g草酸，用水溶解并定容至1L。18.2.3
2，6-二氯靛酚（2，6-二氯靛酚钠盐）溶液：称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中，然后称取2，6-二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却并用水定容至250mL，过滤至棕色瓶内，于4℃～8℃环境中保存。每次使用前，用标准抗坏血酸溶液标定其滴定度标定方法：准确吸取1mL抗坏血酸标准溶液于50mL锥形瓶中，加入10mL偏磷酸溶液或草酸溶液，摇匀，用2.6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色，保持15s不褪色为止。同时另取10mL偏磷酸溶液或草酸溶液做空白试验。2，6-二氯靛酚溶液的滴定度按式（3)计算：T
式中：
.（3）
2.6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
抗坏血酸标准溶液的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V-吸取抗坏血酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL)；GB5009.86—2016
Vt——滴定抗坏血酸标准溶液所消耗2.6-二氯靛酚溶液的体积，单位为毫升（mL)；V。—滴定空白所消耗2.6-二氯靛酚溶液的体积，单位为毫升（mL）。18.3标准品
L（十）-抗坏血酸标准品（C.H.O）：纯度≥99%。18.4标准溶液的配制
L（+）-抗坏血酸标准溶液（1.000mg/mL）：称取100mg（精确至0.1mg)L（+）-抗坏血酸标准品，溶于偏磷酸溶液或草酸溶液并定容至100mL。该贮备液在2℃～8℃避光条件下可保存一周。19测定
整个检测过程应在避光条件下进行。19.1试液制备：称取具有代表性样品的可食部分100g，放入粉碎机中，加人100g偏磷酸溶液或草酸溶液，迅速捣成匀浆。准确称取10g～40g匀浆样品（精确至0.01g）于烧杯中.用偏磷酸溶液或草酸溶液将样品转移至100mL容量瓶，并稀释至刻度，摇匀后过滤。若滤液有颜色，可按每克样品加0.4g白陶土脱色后再过滤
19.2滴定：准确吸取10mL滤液于50mL锥形瓶中，用标定过的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色15s不褪色为止。同时做空白试验。20
结果计算
试样中L（+)-抗坏血酸含量按式(4)计算：(V-V)×TXA
式中：
X—试样中L（+）-抗坏血酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；V滴定试样所消耗2，6-二氯靛酚溶液的体积，单位为毫升（mL）；V。滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积，单位为毫升（mL)；..（4)
T——2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2，6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数(mg/mL);
稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。21精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，在L（十）-抗坏血酸含量大于20mg/100g时不得超过算术平均值的2%。在L（十）-抗坏血酸含量小于或等于20mg/100g时不得超过算术平均值的5%。
L（+)-抗坏血酸、D（+)-抗坏血酸标准色谱图第一法L（+)-抗坏血酸、D(+)-抗坏血酸标准色谱图见图A.1mA
蜂面积：
L+)-抗坏血酸、D(+)-抗坏血酸标准色谱图GB5009.86—2016
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