GB 5009.205-2013 食品安全国家标准 食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定 GB5009.205-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB 5009.205—2013
食品安全国家标准
食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定2013-11-29发布
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2014-06-01实施
GB5009.205—2013
本标准代替GB/T5009.2052007《食品中二嗯英及其类似物毒性当量的测定》。本标准与GB/T5009.2052007相比，主要变化如下：增加了加速溶剂萃取（ASE）方法：增加了WHO于2005年修订后的多氯代二苯并二嗯英及喃和二嗯英样多氯联苯毒性当量因子。
1范围
食品安全国家标准
食品中二嗯英及其类似物毒性当量的测定GB5009.205—2013
本标准规定了食品中17种2,3,7.8-取代的多氯代二苯并二嗯英（PCDDs）、多氯代二苯并呋哺（PCDFs）和12种二嗯英样多氯联苯（DL-PCBs）含量及二嗯英毒性当量（TEQ）的测定方法本标准适用于附录A的表A.1中规定的食品中17种2,3,7,8-取代多氯代二苯并二嗯英及多氯代二苯并呋哺（PCDD/Fs）和12种DL-PCBs含量及其TEQ的测定。2原理
应用高分辨气相色谱一高分辨质谱联用技术，在质谱分辨率大于10000的条件下，通过精确质量测量监测目标化合物的两个离子，获得自标化合物的特异性响应。以目标化合物的同位系标记化合物为定量内标，采用稳定性同位素稀释法准确测定食品中2,3,7,8位氯取代的PCDD/Fs和DL-PCBs的含量；并以各目标化合物的毒性当量因子(TEF)与所测得的含量相乘后累加，得到样品中二嗯英及其类似物的毒性当量（TEQ）。
3试剂和材料
3.1有机溶剂
注：以下有机溶剂均为农残级，浓缩10000倍后不得检出二嗯英及其类似物：3.1.1丙酮（C,H.0）。
正已烷（CH14）。
甲苯（CHg）。
环已烷（CH12）。
二氯甲烷（CH2Cl2）。
乙醚（CHoO）。
甲醇（CHOH）。
正王烷（CH20）。
异辛烷（CgH18）。
乙酸乙酯（CH,cooCH,CH）。
乙醇（CH,CHOH）。
3.2标准溶液
3.2.1PCDD/Fs标准溶液
注：本标准推荐使用EPA1613-1997规定的标准溶液，各实验室可根据具体情况选用相当的标准品。如果需要制备储备溶液，应该在通风橱中进行，并且戴上防毒面罩。1
GB5009.205—2013
3.2.1.1校正和时间窗口确定的标准溶液（CS3WT溶液）：用王烷配制，为含有天然和同位素标记PCDD/Fs（定量内标、净化标准和回收率内标）的溶液，用于方法的校正和确证，并可以用于DB5MS毛细管柱(或等效柱)时间窗口确定和2,3,7,8-TCDD分离度的检查（见附录B的表B.1）。3.2.1.2净化标准溶液：用烷配制的37Cl4-2,3,7,8-TCDD溶液（浓度为40μg/L±2μg/L）。3.2.1.3同位素标记定量内标的储备溶液：用王烷配制的C12-PCDD/Fs溶液（见附录B的表B.2）。3.2.1.4回收率内标标准溶液：用王烷配制的13C12-1,2,3,4-TCDD和13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD溶液（见附录B的表B.3）
3.2.1.5精密度和回收率检查标准溶液（PAR）：用王烷配制的含天然PCDD/Fs溶液（见附录B的表B.4），用于方法建立时的初始精密度和回收率试验（IPR）及过程精密度和回收率试验（OPR）。3.2.1.6保留时间窗口确定的标准溶液(TDTFWD)：用于确定规定毛细管柱中四氯至八氯取代化合物出峰顺序，同时用于检查在规定的色谱柱中2,3,7,8-TCDD和2,3,78-TCDF的分离度（见附录B的表B.6）。3.2.1.7校正标准溶液：为含有天然和同位素标记的PCDD/Fs系列校正溶液（见附录B的表B.7），其中CSL为浓度更低的天然PCDD/Fs校正溶液，用于质谱系统校正。测定校正标准溶液，可以获得天然与标记PCDD/Fs的相对响应因子（RRF）。此外，CS3用于已建立RRF的日常校正和校正曲线校验(VER)；CS1用于检查HRGC-HRMS必须具备的灵敏度。由于食品要求的灵敏度更低，可以使用CSL进行灵敏度检查。
3.2.2DL-PCBs标准溶液
注：本标准推荐使用EPA1668A规定的标准溶液，各实验室可根据具体情况选用相当的标准品。如果需要制备储备溶液，应该在通风橱中进行，并且戴上防毒面罩。3.2.2.1时间窗口确定和定量内标标准溶液：用王烷配制的含同位素标记DL-PCBs的溶液（见附录B的表B.8）。
3.2.2.2同位素标记的净化内标标准溶液：用王烷配制含13C12-2,4,4-TrPCB、3C12-2,3,3,5,5-PePCB和13C12-2,2,3,3,5,5,6-HPCB溶液（见附录B的表B.9）。3.2.2.3同位素标记的回收率内标标准溶液：用王烷配制含13C12-2,2,5,5-TePCB、13C2-2,2,4'5,5'-PePCB、13C12-2,2,34,4,5-HxPCB和3C12-2,23,3'4,4,5,5'-ctaPCB溶液（见附录B的表B.10）。
3.2.2.4精密度和回收率检查标准溶液(PAR)：用王烷配制的含天然DL-PCBs溶液（见附录B的表B.11），用于方法建立时的初始精密度和回收率试验（IPR）及过程精密度和回收率试验（OPR）3.2.2.5校正标准溶液：为含有天然（目标化合物）和同位素标记（定量内标、净化标准和回收率内标）的DL-PCBs系列校正溶液（见附录B的表B.12）。其中CS3用于已建立RRF的日常校正和校正曲线校验(VER)，CS1用于检查HRGC-HRMS必须具备的灵敏度。3.2.2.6高灵敏度检查的标准溶液：为天然DL-PCBs的溶液（浓度0.2μg/L，见附录B的表B.13）。3.2.2.7校正检查的标准溶液：浓度相当于CS3，不含同位素标记，仅为天然DL-PCBs的溶液（50μg/L，见附录B的表B.14）。
3.3样品净化用吸附剂
注：样品净化用吸附剂应在制备后尽快使用，如果经过一段较长时间的保存，应检验其活性。在装有氧化铝和硅胶等容器上应标识其制备日期或开封日期。如果标识不可辨认，应废弃吸附剂，重新制备。由于存在PCBs污染问题，有时适合于PCDD/Fs测定的试剂不一定适合DL-PCBs的测定，应该经过检查证实没有干扰后使用。3.3.1氧化铝
注：如果内标化合物的回收率能达到要求，则可在酸性氧化铝或碱性氧化铝中选择一种用于样品提取液净化。但所有样品，包括初始精确度和回收率检查试验，均应使用同样类型的氧化铝3.3.1.1酸性氧化铝：在130C下至少加热活化12h。2
GB5009.205—2013
3.3.1.2碱性氧化铝：在600°C下至少加热活化24h。加热温度不能超过700℃，否则其吸附能力降低。活化后保存在130℃的密闭烧瓶中。应在烘烤后五天内使用。3.3.2硅胶
3.3.2.1规格：75μm~250um或相当等级的硅胶。3.3.2.2活性硅胶：使用前，取硅胶分别用甲醇、二氯甲烷清洗，在180℃下至少烘烤1h或150℃下至少烘烤4h（最多6h）。在干燥器中冷却，保存在带螺帽密封的玻璃瓶中。3.3.2.3酸化硅胶（44%，质量分数）：称取56g活性硅胶置于250mL具塞磨口旋转烧瓶中，在玻璃棒搅拌下加入44g硫酸，将烧瓶用旋转蒸发器旋转1h～2h，使之混和均匀无结块，置干燥器内，可保存3周。
3.3.2.4碱化硅胶（33%，质量分数）：称取100g活性硅胶置于250mL具塞磨口旋转烧瓶中，在玻璃棒搅拌下逐滴加入49gNaOH溶液（1mol/L），将烧瓶用旋转蒸发器中旋转1h～2h，使之混和均匀无结块。将碱化硅胶置干燥器内保存。3.3.2.5硝酸银硅胶：称取10g硝酸银置于100mL烧杯中，加水40mL溶解。将该溶液转移至250mL旋转烧瓶中，慢慢加入90g活性硅胶，在旋转蒸发器中旋转1h～2h，使之干燥并混和均匀。取出后，在干燥器中冷却，置于褐色玻璃瓶内保存。3.3.3弗罗里土
3.3.3.1规格：150um~250um。使用前，称取500g，装入索氏提取器中，用适量正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）提取24h。
3.3.3.2含水1%（质量分数）的弗罗里土：称取弗罗里土99.0g，加水1.0mL，搅拌均匀，用带聚氟乙烯螺帽的玻璃瓶封装。
3.3.4混合活性炭
称取9.0gCarbopakC（推荐使用Supelco1-0258，或其他相当的类型）和41.0gCelite545（推荐使用Supelco2-0199，或其他相当的类型），充分混和，含活性炭为18%（质量分数)。在130C中至少活化6h，在干燥器中保存。
3.4其他材料
3.4.1无水硫酸钠（Na2SO4）：优级纯。3.4.2硫酸（H2SO4）：优级纯。3.4.3氢氧化钠（NaOH）：优级纯。3.4.4硝酸银（AgNO3）：优级纯。3.4.5草酸纳（Na2C2O4）：优级纯3.4.6玻璃棉：使用前以二氯甲烷及正已烷回流48h，用氮气吹干后，置于棕色瓶内备用。3.4.7凝胶色谱填料：Bio-BeadsS-X3，38μum~75um。3.4.8硅藻土（选用）：加速溶剂萃取用。3.5参考基质
玉米油或其他植物油。基质中未检出PCDD/Fs和DL-PCBs为最理想的情况。由于环境中PCBs的广泛存在，植物油中可能存在背景水平的PCBs，作为基质时要求其背景水平不得超过附录C表C.1中的检测限的值。
4仪器和设备
4.1高分辨气相色谱-高分辨质谱仪(HRGC-HRMS)。3
4.2气相色谱柱，不同的目标物应选用不同的气相色谱柱：GB5009.205—2013
a）用于PCDD/Fs检测：DB-5ms（5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷）柱，60m×0.25mmx0.25μm或等效色谱柱；RTX-2330（90%双氰丙基-10%苯基氰丙基聚硅氧烷），60m×0.25mm×0.1um或等效色谱柱：
b)用于DL-PCBs检测：DB-5ms柱，60mx0.25mmx0.25μm或等效色谱柱。4.3组织匀浆器。
4.4绞肉机。
4.5冻干机。
4.6旋转蒸发器。
4.7氮气浓缩器。
4.8超声波清洗器。
4.9振荡器。
4.10索氏提取器。
4.11天平：感量为0.1mg
恒温干燥箱：用于烘烤和贮存吸附剂，能够在105℃~250℃范围内保持恒温（±5℃）。4.12
玻璃层析柱：带聚四氟乙烯柱塞，150mm×8mm，300mm×15mm4.14全自动样品净化系统（选用）：配备酸碱复合硅胶柱、氧化铝和活性炭净化柱。4.15凝胶色谱系统（GPC）（选用，手动或自动系统）：玻璃柱（内径15mm～20mm），内装50gS-X3凝胶。
4.16高效液相色谱仪（HPLC）（选用）：包括泵、自动进样器、六通转换阀、检测器和馏分收集器，配备Hypercarb（100mmx4.6mm，5μm）或相当色谱柱。4.17加速溶剂萃取仪（选用）。5试样制备与净化
5.1样品采集与保存
5.1.1现场采集的样品用避光材料如铝箔、棕色玻璃瓶等包装，置冷冻箱中运输到实验室，-10℃以下低温保存。
5.1.2液体或固体样品，如鱼、肉、蛋、奶等经过匀浆使其匀质化后可使用冷冻干燥或无水硫酸钠干燥，混匀。油脂类样品可直接用正已烷溶解后进行净化分离。5.2试样制备
5.2.1溶剂和提取液的旋转蒸发浓缩5.2.1.1连接旋转蒸发器，将水浴锅预热至45℃。在试验开始前，预先将100mL正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）作为提取溶剂浓缩，以清洗整个旋转蒸发仪系统。如有必要，对经浓缩后的溶剂以及收集瓶中的溶剂进行检验，以便对污染状况进行检查。在两个浓缩样品之间，分三次用2mL～3mL溶剂洗涤旋转蒸发仪接口，用烧杯收集废液，5.2.1.2将装有样品提取液的茄形瓶连接到旋转蒸发器上，缓慢抽真空。5.2.1.3将茄形瓶降至水浴锅中，调节转速和水浴的温度（或真空度），使浓缩在15min～20min内完成。在正确的浓缩速度下，流入废液收集瓶中的溶剂流量应保持稳定，溶剂不能有爆沸或可见的沸腾现象发生。
注：如果浓缩过快，可能会使样品损失。5.2.1.4当茄形瓶中溶剂约为2mL时，将茄形瓶从水浴中移开，停正止旋转。缓慢并小心地向旋转蒸发仪中放气，确保打开阀门时不要太快，以免样品冲出茄形瓶。用2mL溶剂洗涤接口，用烧杯收集废液。
5.2.2索氏提取
GB5009.205—2013
5.2.2.1提取前，在索氏提取器中装入一支空的纤维素或玻璃纤维提取套筒，以正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）为提取溶剂，预提取8h后取出晾干。5.2.2.2将下列处理好的样品装入提取套筒中（附录D图D.1），高度以不超过溢流管为限。在提取套简中加入适量13C12标记的定量内标的储备溶液（3.2.1.3），用玻璃棉盖住样品，平衡30min后装入索氏提取器，以适量正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）为溶剂提取18h～24h，回流速度控制在3次/h~～4次/h。
鱼、肉、蛋、奶等样品：称取50g~200g样品（精确到0.001g），经过冷冻干燥后，准确称重，计算含水量。根据估计的污染水平，称取适量试样（精确到0.001g），加无水硫酸钠研磨，制成能自由流动的粉末。将粉末全部转移至处理好的提取套筒，置于索氏抽提器中进行提取。奶酪等固体乳制品样品：将奶酪直接研成细末后称量，其他固体乳制品直接称量。称取适量试样（通常为10g，精确到0.001g），置研钵中，加无水硫酸钠，研磨成干燥的、可以自由流动的粉末。无水硫酸钠与海砂混合物使用量取决于试样的取样量及含水量。将粉未全部移至处理好的提取套筒。用沾有正已烷的棉签将研钵、表面血和研磨棒擦净。该棉签一同放入套筒中进行提取。注：当已知样品含量或估计其含量较高时，应适当减少用于分析的试样量。所有试样、空白试验、初始精密度及回收率试验（IPR）、过程精密度及回收率试验（OPR）应具有相同的分析过程，以便检查污染来源及损失情况。5.2.2.3提取后，将提取液转移到茄形瓶中，旋转蒸发浓缩至近干。5.2.2.4茄形瓶中的残留物用少量正已烷溶解以进行下面的净化。如需要考察净化过程的回收率则加入净化标准溶液（3.2.1.2），但日常的分析中该步骤可省略。5.2.2.5若结果报告需报告脂肪含量，则需要测定样品的脂肪含量。测定脂肪含量后，可以加少量正已烷溶解，以备进行净化处理。5.2.2.6脂肪含量的测定：浓缩前准确称重茄形瓶，将溶剂浓缩至干后准确称重茄形瓶，两次称重结果的差值为试样的脂肪量，
按式（1）计算脂肪含量：
X,=×100%
式中：
X脂肪含量，%：
m—试样的脂肪量，单位为克（g）；m2试样的质量，单位为克（g）。5.2.3液液萃取
5.2.3.1依情况准确量取液体奶样样品200mL～300mL，转移至大小合适的分液漏斗中，加入适量13Cl2标记的定量内标的储备溶液（3.2.1.3）。5.2.3.2按20mg/g样品的比例称取草酸钠，加少量水溶解后，将该溶液加入样品，充分振摇。5.2.3.3加入与样品等体积的乙醇，再进行振摇。5.2.3.4在样品-乙醇溶液中加入与5.2.3.3等体积的乙醚：正已烷（2:3，体积比），振摇1min。静置分层后，转移出有机相。然后在水相中加入与样品原始体积相同的正已烷，振摇1min。静置分层后转移出有机相。合并有机相，浓缩至小于75mL5.2.3.5转移提取液至250mL分液漏斗中，加入30mL蒸馏水振摇，弃去水相。5.2.3.6转移上层有机相至250mL烧瓶中，加入适量无水硫酸钠，振摇。静置30min后，用一张经过甲苯淋洗过的滤纸过滤，滤液置于茄形瓶中。5.2.3.7将提取液转移到茄形瓶中，旋转蒸发浓缩至近干。如需测定脂肪含量，则按5.2.2.6步骤进行脂肪含量的测定
GB5009.205—2013
5.2.3.8茄形瓶中的残留物用少量正已烷溶解以进行下面的净化。如需要考察净化过程的回收率则加入净化标准溶液（3.2.1.2），但日常的分析中该步骤可省略。5.2.4加速溶剂萃取
5.2.4.1提取前应将所用萃取池以正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）进行清洗。5.2.4.2将下列处理好的样品装入萃取池中。萃取池中应预先放入醋酸纤维素过滤膜。在萃取池中加入适量13C12标记的定量内标的储备溶液（3.2.1.3），密闭后，放于萃取仪上，以正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）为溶剂提取。参考条件为：温度，150℃：压力，10.3MPa（1500psi）；循环，1次；静态时间，10min。
鱼、肉、蛋等含水量较高样品：称取50g～200g样品（精确到0.001g），经过冷冻干燥后，准确称重，计算含水量。根据估计的污染水平，称取适量试样（精确到0.001g），置研钵中，研磨成粉状，加入硅藻土，混匀后，全部转移至处理好的萃取池。液体乳样品：准确称取80g100g样品（精确到0.001g），经过冷冻干燥后，置研钵中，研磨成粉状，加入硅藻土，混匀后，全部转移至处理好的萃取池。干燥样品：研磨成粉后，根据估计的污染水平，称取适量试样（精确到0.001g），置研钵中，加入硅藻主，混匀后，全部转移至处理好的萃取池，每个样品所对应硅藻土用量取决于所应用的萃取池的体积和所称取的该样品研磨后的体积。5.2.4.3提取后，进一步处理按5.2.2.3～5.2.2.6步骤进行。5.2.5其他
取适量黄油等油脂试样置烧杯中，加热至50℃~60℃，使油脂明显地分离出来。融化的油脂经干燥的滤纸或者一小段玻璃棉过滤到另一容器中，从中准确称取油脂样品适量（精确到0.001g），用正已烷溶解后，加入适量\3C12标记的定量内标。5.3试样净化
5.3.1酸化硅胶净化
5.3.1.1在浓缩的样品提取液中加入100mL正已烷，并加入50g酸化硅胶，用旋转蒸发仪在70℃条件下旋转加热20min。
5.3.1.2静置8min10min后，将正已烷倒入茄形瓶中。5.3.1.3用50mL正已烷洗瓶中硅胶，收集正已烷于5.3.1.2的茄形瓶中，重复3次。用旋转蒸发仪浓缩至 2 mL~5 mL。
如果酸化硅胶的颜色较深，则应重复上述过程，直至酸化硅胶为浅黄色，5.3.2混合硅胶柱净化
5.3.2.1层析柱的填充：取内径为15mm的玻璃柱，底部填以玻璃棉后，依次装入2g活性硅胶、5g碱性硅胶、2g活性硅胶、10g酸化硅胶、2g活性硅胶、5g硝酸银硅胶、2g活性硅胶和2g无水硫酸钠。干法装柱，轻敲层析柱，使其分布均匀（见附录D图D.3）。5.3.2.2用150mL正已烷预淋洗层析柱。当液面降至无水硫酸钠层上方约2mm时，关闭柱阀，弃去淋洗液，柱下放一茄形瓶。检查层析柱，如果出现沟流现象应重新装柱。5.3.2.3将已浓缩的提取液加入柱中，打开柱阀使液面下降，当液面降至无水硫酸钠层时，关闭柱阀。5.3.2.4用5mL的正已烷洗涤原茄形瓶（5.3.1.3）2次，将洗涤液一并加入柱中，打开柱阀，使液面降至无水硫酸钠层。
5.3.2.5如果仅测定PCDD/Fs，则用350mL正已烷洗脱：如果同时测定PCDD/Fs和DL-PCBs，则用400mL正已烷洗脱，收集洗脱液。6
GB5009.205—2013
5.3.2.6将收集在茄形瓶中的洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至3mL～5mL，供下一步净化用。5.3.3氧化铝柱净化
注：本标准中使用的两种氧化铝柱仅是吸附剂用量不同。氧化铝柱1为25g碱性氧化铝，氧化铝柱2为2.5g碱性氧化铝（见附录D图D.4）。
5.3.3.1氧化铝柱1
5.3.3.1.1层析柱填充：取内径为15mm的玻璃柱，底部填以玻璃棉后，依次装入25g氧化铝、10g无水硫酸钠。于法装柱，轻敲层析柱，使吸附剂分布均匀。5.3.3.1.2用150mL正已烷预淋洗层析柱，当液面流至氧化铝上方约2mm时，关闭柱阀。弃去淋洗液，检查层析柱，如果出现沟流现象应重新填柱。5.3.3.1.3加入经过混合硅胶柱净化的提取液，并用5mL正已烷分两次洗涤原茄形瓶（5.3.2.6），将洗涤液合并后上柱，重复洗涤一次。5.3.3.1.4用60mL正已烷清洗烧瓶后淋洗氧化铝柱，弃去淋洗液。5.3.3.1.5仅测定PCDD/Fs时：用200mL正已烷：二氯甲烷（98:2，体积比）淋洗干扰组分，弃去淋洗液。柱下放一茄形瓶，用200mL正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）洗脱，收集洗脱液，加入3mL的辛烷或主烷，供PCDD/Fs分析用。5.3.3.1.6同时测定PCDD/Fs和DL-PCBs时：柱下放一茄形瓶，用90mL甲苯洗脱，收集洗脱液，加入3mL的辛烷或王烷，供DL-PCBs分析用。柱下放置另一茄形瓶，再用200mL正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）洗脱，收集洗脱液，加入3mL的辛烷或壬烷，供PCDD/Fs分析用。5.3.3.1.7将收集在茄形瓶中的各洗脱液分别用旋转蒸发仪浓缩至3mL～5mL，供下一步净化用。5.3.3.2氧化铝柱2
层析柱填充：
a）取内径为6mm~7mm的玻璃柱，底部填以玻璃棉后，依次装入2.5g氧化铝和2g无水硫酸钠。干法装柱，轻敲层析柱，使吸附剂分布均匀；b）用20m正已烷预淋洗层析柱，弃去淋洗液。检查层析柱是否有沟流，如果出现沟流应重新填柱；
c）加入经氧化铝柱1净化的提取液（PCDD/Fs部分），使其完全渗入柱内；d）用4mL正已烷：二氯甲烷（98:2，体积比）冲洗原茄形瓶（5.3.3.1），将冲洗下来的溶液，倒入柱内，让其完全渗入柱内；重复一次；e）用40mL的正已烷：二氯甲烷（98:2，体积比）（包括烧瓶清洗）淋洗，弃去淋洗液，柱下放一茄形瓶；
f）用30mL正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）淋洗液洗脱PCDD/Fs，收集洗脱液，加入3mL的辛烷或王烷；
g）用30mL正已烷：二氯甲烷（99:1，体积比）预淋洗层析柱，弃去淋洗液，柱下放一茄形瓶。检查层析柱是否有沟流现象，如果出现沟流应重新装柱；k）加入浓缩后的经氧化铝柱1净化的提取液（DL-PCBs部分），让其完全渗入柱内；1）用5mL正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）洗涤原茄形瓶（5.3.3.1）两次。当样品已完全渗入柱内，将冲洗下来的溶液，倒入柱内，使其完全渗入柱内；m）用15mL正已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）洗脱，收集洗脱液，加入3mL的辛烷或王烷：n）将收集在茄形瓶中的各洗脱液分别用旋转蒸发仪浓缩至3mL5mL左右，供进一步测定或净化用。
5.3.4凝胶渗透柱净化
注：用于去除样品提取液中类脂的备选净化方法，必要时选择。GB5009.205—2013
5.3.4.1在层析柱底部填上玻璃棉，装入50gBio-BeadsS-X3凝胶，用甲苯冲洗后，保存在环已烷：乙酸乙酯（1:1，体积比）中。
注：凝胶柱放置时，溶剂不得流空。5.3.4.2在样品提取液（通常浓缩至3mL～5mL）中加少量正已烷，注入层析柱，使样品提取液完全渗入柱内。
5.3.4.3用10mL环已烷：乙酸乙酯（1:1，体积比）分两次洗涤原茄形瓶，转入柱内。5.3.4.4用100mL环已烷：乙酸乙酯（1:1，体积比）淋洗，弃去淋洗液，柱下放一茄形瓶。5.3.4.5用90mL环已烷：乙酸乙酯（1:1，体积比）洗脱，得到的洗脱液中含PCDD/Fs和DL-PCBs。5.3.5活性炭柱净化
注：PCDD/Fs和非邻位氯取代的DL-PCBs备选的净化方法，必要时选择。5.3.5.1活性炭柱制备：取5mL一次性玻璃移液管，切除上端约3.8cm处并挫磨锐缘处，取适量玻璃棉置入并以两只1mL玻璃移液管于刻度“0”处塞紧，依次填入0.5mL活性硅胶、0.7mLCarbon/Celite545、0.5mL活性硅胶，取适量玻璃棉置入并塞紧。使用前用下列溶剂依次淋洗：4mL甲苯、2mL二氯甲烷：甲醇：甲苯（75:20:5，体积比）和4mL环已烷：二氯甲烷（1:1，体积比）。5.3.5.2净化：先以2.5mL甲醇及2.5mL二氯甲烷：正已烷（1:1，体积比）溶液依次将活性炭柱（切口端向上）淋洗两次，奔去淋洗液，倒置柱管（切口端向下），将浓缩到约1mL的提取液（已进行除脂处理）小心移入活性炭柱，然后用1mL二氯甲烷：正已烷（1:1，体积比）溶液洗涤原瓶两次，并移入活性炭柱内，待液面流至玻璃棉时，用吸球吹出柱内溶剂。再次倒置管柱（切口端向上），用25mL甲苯洗脱柱子，用50mL茄形瓶收集洗脱液。5.3.5.3收集的洗脱液加入3mL的辛烷或王烷。将收集的洗脱液分别用旋转蒸发仪浓缩至3mL~5mL。
5.3.6弗罗里土柱净化
注：PCDD/Fs备选的净化方法，必要时选择5.3.6.1层析柱填充：取直径为15mm的玻璃柱，底部填上玻璃棉后，依次装入2g无水硫酸钠、15g弗罗里土、2g无水硫酸钠。以正已烷湿法装柱，轻敲层析柱，使吸附剂分布均匀。5.3.6.2用200mL正已烷淋洗已被活化的弗罗里土柱，当液面至距无水硫酸钠层约2mm时，关闭柱阀，弃去淋洗液。www.bzxz.net
5.3.6.3加入浓缩后的提取液（已进行除脂处理），打开柱阀。5.3.6.4用正已烷洗涤原茄形瓶2次，合并至弗罗单士柱中。5.3.6.5用200mL正已烷淋洗干扰组分，弃去淋洗液，柱下放一茄形瓶。5.3.6.6用300mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，5.3.6.7将3mL辛烷或王烷加入收集的洗脱液中，将收集的洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至3mL～5mL5.3.7全自动样品净化系统自动净化分离注：全自动样品净化系统的自动净化分离原理与传统的柱色谱方法相同，该系统使用三根一次性商业化净化柱，依次为多层硅胶柱、碱性氧化铝柱和活性炭柱。整个净化过程通过计算机按设定程序控制往复泵和阀门进行。5.3.7.1由于全自动样品净化系统提供的净化柱存在容量问题，在处理高脂肪含量时需要预先使用酸化硅胶去除样品中的大部分脂肪。这可以通过在全自动样品净化系统中增加一个大容量酸化硅胶柱解决；也可以合并采用任选步骤5.3.1、5.3.2或5.3.4或组合方法手动去除样品中的大部分脂肪，予以解决。注：当样品回收率出现异常时，应对全自动样品净化系统流速进行校正。5.3.7.2按仪器使用说明要求，连接净化层析柱。5.3.7.3将各净化柱按顺序连接在全自动样品净化系统上，按程序配好各洗脱溶液并连接好管路，设定计算机洗脱程序（参见附录D图D.5）。8
GB5009.2052013
5.3.7.4将经酸化硅胶或者凝胶渗透色谱处理的浓缩提取液转移到全自动样品净化系统的进样管。5.3.7.5按照洗脱流程图顺序洗脱（参见附录D图D.5），对样品进行净化、分离，分别收集PCDDs/Fs和DL-PCBs组分。
5.3.7.6将收集的各洗脱液分别用旋转蒸发仪浓缩至3mL～5mL。5.3.8其他
为了将PCDD/Fs和DL-PCBs从基质材料中充分地分离出来，可根据基质材料或干扰组分的具体情况选用不同的吸附剂进行净化。制备酸化硅胶以除去组织样品中的脂肪。凝胶渗透色谱可用来除去那些能导致气相色谱柱柱效降低的大分子于扰物（如蜂蜡等酸碱不能破坏的大分子），必要时可用手动层析柱对提取液进行初步净化。酸性、中性和碱性硅胶、氧化铝和弗罗里土可用于消除非极性和极性的干扰物质。活性炭柱能将PCDD/Fs以及非邻位氯取代的PCB77、PCB126和PCB169与其他同类物质和干扰物质分离，可在必要时使用。除了非邻位氯取代的PCB77、PCB126和PCB169外，其他DL-PCBs一般不需要活性炭柱净化。HPLC可以特异性地分离某些类似物和同系物。通常在用酸化硅胶或凝胶渗透色谱除去组织样品中的类脂后，使用3根层析柱净化，即一根混合型硅胶柱和两根不同的氧化铝柱，PCDD/Fs和DL-PCBs净化流程图见附录D图D.2。也可以采取其他备选净化方法，组合使用。无论采用何种组合，在进行净化前，实验室应证实其选择的净化过程能满足方法的要求。
5.4：微量浓缩与溶剂交换
5.4.1提取物的溶剂交换
5.4.1.1将浓缩的提取液转移到带聚四氟乙烯硅胶垫的棕色螺口瓶中，置手氮气浓缩器下吹氮浓缩（可在45℃的控温条件下进行）
注：气流过大会引起样品损失，氮气流速调节到能够使溶剂表面轻微振动。5.4.1.2如果需要称重，有必要将提取物用氮气吹至恒重。5.4.1.3如果属于提取液净化溶剂更换，按以下步骤操作：a）如果采用凝胶色谱系统(GPC)净化，需在凝胶色谱系统(GPC)进样前用二氯甲烷将提取液体积调至5.0mL。如果用HPLC净化，则需在HPLC进样前将提取液浓缩至1.0mL。b）如果用层析柱（硅胶、活性炭或弗罗里土）进行净化，则需将提取物溶剂转换成正已烷，并定容至1.0mL。
5.4.2净化后的微量浓缩与溶剂交换如果提取液浓缩后用于HRGC/HRMS分析，则将净化分离后得到的各流分分别用旋转蒸发仪浓缩至3mL～5mL，再在氮气下浓缩至1mL～2mL，然后在氮气流下定量转移至装有0.2mL的锥形衬管的进样瓶中，并用正已烷洗涤浓缩蒸馏瓶，一并转入锥形衬管中。待浓缩至约100，分别加入适量PCDDs/Fs和DL-PCBs回收率内标溶液，王烷（可用辛烷代替）定容。继续在细小的氮气流下浓缩至溶剂只含王烷或辛烷。样品溶液的最终体积可根据情况调整，大约为20证。将进样瓶密封，并标记样品编号。室温下暗处保存，供HRGC/HRMS分析用。如果样品当日不进行HRGC/HRMS分析，则于<-10℃下保存。
PCDD/Fs和DL-PCBs的分析流程图可参见附录D的图D.2。6PCDD/Fs色质分析
6.1HRGC/HRMS条件
6.1.1GC的色谱条件
推荐筛选色谱柱为DB-5ms柱或等效柱，柱长60m、内径0.25mm、液膜厚度0.25μum；对于9
GB5009.205—2013
2,37,8-TCDF的确证推荐使用DB-235ms柱或等效柱，柱长30m、内径0.25mm、液膜厚度0.25μum：也可以使用RTX-2330或等效柱，柱长50m~60m、内径0.25mm、液膜厚度0.20μm。注：为了得到最佳的分离度和灵敏度，需要优化GC色谱条件，且优化后，标准溶液、空白、IPR及OPR检查和样品检测都应采用相同的GC条件。采用DB-5ms色谱柱或等效柱的推荐条件：a）进样口温度：280℃；
b）传输线温度：310℃；
c）柱温：120℃（保持1min）；以43℃/min升温速率升至220℃（保持15min）：以2.3℃/min升温速率升至250℃，以0.9℃/min升温速率升至260℃，以20℃/min升温速率升至310℃（保持9min）；
d）载气：恒流，0.8mL/min。
采用RTX-2330色谱柱或等效柱的推荐条件（供选择使用）：a）进样口温度：280℃：
b）传输线温度：260℃：
c）柱温：90℃（保持1.5min）：以25℃/min升温速率升至180℃；再以2℃/min升温速率升至260℃（保持30min）：
d）载气：恒流，1mL/min。
6.1.2质谱参数
6.1.2.1分辨率：在分辨率≥10000的条件下，进样PCDD/Fs单标或目标化合物与相邻组分没有干扰的混标溶液，监测附录C的表C.3规定的各化合物两个精确质量数的离子，得到其选择离子流图6.1.2.2质量校正：PCDD/Fs分析的运行时间可能超过质谱仪的质量稳定期。这是由于质谱仪在高分辨模式下运行时，百万分之几的质量数偏移（如百万分之五质量数）可能对仪器的性能产生严重影响，为此，需要对偏移的质量进行校正。可以采用参考气（全氟煤油，PFK：或全氟三丁胺，FC43）的质量数锁定进行质量偏移校正。锁定的质量数取决于附录C的表C.3各窗口中监测的精确质量数。分析过程中调节进入HRMS中参考气的量，要求监测的锁定质量数信号强度不得超过检测器满量程的10%注：过量的参考气可能引起噪声且增加对离子源的污染，导致清洗离子源的频率增加。6.1.2.3选择一个参考气离子碎片，如接近m/z304（TCDF）的m/z304.9824（PFK）信号，调整质谱以满足最小所需的10000分辨率（10%峰谷分离）。分辨率应大于或等于10000，精确的m/z与附录C的表C.3中的理论m/z之间的偏差应小于百万分之五。6.1.2.4在给定的GC条件下，进样1μL或2uLCS1校正溶液（附录B的表B.7)，考察离子丰度比、最小水平、信噪比及绝对保留时间：a）测定各目标化合物峰面积，计算附录C的表C.3中规定的精确质量数离子的丰度比，并与附录C的表C.4中理论值比较，并符合质量控制的要求；否则需要调谐质谱仪，重新测定，使其符合规定，并对质谱仪的分辨率进行确认；b）各窗口有必要进行连续监测，确保在GC运行中能够监测全部PCDD/Fs。各窗口中监测的精确质量数离子参见附录C的表C.3。如果仅测定2,3,78-TCDD和2.3,7,8-TCDF，则将窗口修改为包括四氯和五氯异构体、二苯醚和锁定质量数：c）HRGC/HRMS应满足附录C的表C.1最低检测限要求，进样CS1时PCDD/Fs和标记化合物的信噪比应大于10:1
d）13C12-1,2,3,4-TCDD在DB-5柱上的绝对保留时间应大于25.0min。6.1.3保留时间窗口确定
采用优化的升温程序，进样时间窗口确定的标准溶液。附录B的表B.5给出了时间窗口确定的标准溶液流出顺序（最先出峰、最后出峰）。如果仅检测2,3,7,8-TCDD和2,3,7,8-TCDF，则无须进行时间10
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。