GB 5009.208-2016
基本信息
标准号： GB 5009.208-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中生物胺的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB 5009.208-2016 食品安全国家标准 食品中生物胺的测定
GB5009.208-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.208—2016
食品安全国家标准
食品中生物胺的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.208—2016
本标准代替GB/T5009.208—2008《食品中生物胺含量的测定》、GB/T20768—2006《鱼和虾中有毒生物胺的测定液相色谱-紫外检测法》、SN/T2209一2008《进出口水产品中有毒生物胺的检测方法高效液相色谱法》，及GB/T5009.45一2003《水产品卫生标准的分析方法》中组胺检测部分。本标准与GB/T5009.208—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中生物胺的测定”；—增加了分光光度法；
——增加了章鱼胺；
修改了酒类和醋酱油的测定；
修改了流动相和洗脱梯度；
修改了样品前处理方法；
适用范围删除了乳制品。
1范围
食品安全国家标准
食品中生物胺的测定
液相色谱法
第一法
GB5009.208—2016
本标准规定了食品中色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、章鱼胺、酪胺、亚精胺和精胺含量的测定方法。
本标准适用于酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒等）、调味品（醋和酱油）、水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）、肉类中生物胺的测定。
水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）、肉类：试样用5%三氯乙酸提取，正已烷去除脂肪，三氯甲烷-正丁醇（1十1)液液萃取净化后，丹磺酰氯衍生，C1：色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。
酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒等）、调味品（醋和酱油）：试样用丹磺酰氯衍生，C1色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，3.1试剂
乙腈（CHCN）：色谱纯。
丙酮（C,H.O)：色谱纯。
乙醚（CHi.O)：重蒸。
正丁醇(C,H.O)。
三氯甲烷（CHCI）。
正已烷（C,Hi4）：色谱纯
乙酸(CHCOOH)：色谱纯
乙酸铵（CH.COONH）：色谱纯
谷氨酸钠（CHNNaO,）。
碳酸氢钠（NaHCO）。
氯化钠(NaCI)。
氢氧化钠(NaOH)。
盐酸（HC1,37%）。
三氯乙酸（C,HCl,O,）。
GB5009.208—2016
3.1.15丹磺酰氯（Dansylchloride.C12Hi2CINO,S.CAS号：605-65-2，纯度>99%）。3.2试剂配制
3.2.1丹磺酰氯衍生剂溶液：准确称取丹磺酰氯适量，以丙酮为溶剂配制浓度为10mg/mL.的衍生剂使用液，置4℃冰箱避光储存。
3.2.25%三氯乙酸溶液：准确称取25g三氯乙酸于250mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至500mL容量瓶中.定容至刻度。
3.2.31mol/L盐酸溶液：准确量取8.6mL盐酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。3.2.40.1mol/L盐酸溶液：准确量取1mol/L盐酸溶液10mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3.2.51mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加入100mL水完全溶解。3.2.6正丁醇/三氯甲烷（1十1)混合溶液：分别量取相同体积的正丁醇和三氯甲烷混合均匀即可。3.2.7饱和碳酸氢钠溶液：称取15g碳酸氢钠，加人100mL水溶解，取上清液即为饱和溶液，3.2.8
50mg/mL谷氨酸钠溶液：准确称取5.0g谷氨酸钠用饱和碳酸氢钠溶液溶解并定容至100mL3.2.9含1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液：称取0.77g乙酸铵溶解于水中，转移至1000mL容量瓶中，加入10mL甲酸，用水定容至刻度。3.2.10
流动相A：量取100mL含1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液加入900mL乙腈。3.2.11流动相B：量取900mL含1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液于加人100mL乙睛。3.3标准品
组胺盐酸盐（Histaminedihydrochloride，C,H,N2HCl，CAS号：56-92-8）标准品（纯度>99%）。
3.3.2β-苯乙胺盐酸盐（β-phenylethylaminehydrochloride，C.HiN·HCl，CAS号：64-04-0）标准品（纯度>98%）。
酪胺盐酸盐（Tyraminehydrochloride，CHnNO·HCl，CAS号：60-19-5）标准品（纯度3.3.3
>98%）
3.3.4腐胺盐酸盐（Putreseinedihydrochloride，C,Hi2Nz·2HCl，CAS号：333-93-7）标准品（纯度>98%）。
3.3.5胺盐酸盐（Cadaverinedihydrochloride，C,HN，·2HCl,CAS号：1476-39-7）标准品（纯度>98%)
3.3.6色胺盐酸盐（Tryptaminehydrochloride，C1HizNz·HCl,CAS号：61-54-1）标准品（纯度>99%)。
3.3.7精胺盐酸盐（Sperminetetrahydrochloride，Ci,H26N·4HCl.CAS号：306-67-2）标准品（纯度>97%)。
3.3.8亚精胺盐酸盐（Spermidinetrihydrochloride，CH，N，·3HCl，CAS号：334-50-9）标准品（纯度>97%)。
3.3.9章鱼胺盐酸盐（Octopaminehydrochloride，CHnNOzHCl，CAS号：770-05-9）标准品（纯度>97%)。
3.3.101.7-二氨基庚烷（1，7-Diaminoheptane.C,HisNz，CAS号：646-19-5）内标标准品（纯度>98%)。
3.4标准溶液配制
注：标准溶液的配制浓度以各生物胺单体计算，称取标准品时应对其中的盐酸盐进行折算。所有标准溶液配制好2
后均需转移至密闭棕色容器申，避光贮存GB5009.208—2016
3.4.1生物胺标准储备溶液的配制：准确称取各种生物胺标准品适量，分别置于10mL小烧杯中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解后转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，配制成浓度为1000mg/L（以各种生物胺单体计的标准储备溶液，置一20℃冰箱储存。保存期为6个月。3.4.2生物胺标准混合使用液的配制：分别吸取1.0mL各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸稀释至刻度.混匀，配制成生物胺标准混合使用液（100mg/L）。保存期为3个月。
3.4.3生物胺标准系列溶液的配制：分别吸取0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL、1.50mL、2.50mL、5.0mL生物胺标准混合使用液（100mg/L），置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，使浓度分别为1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L、50.0mg/L，临用现配。
3.4.4内标标准储备溶液的配制：准确称取内标标准品适量，置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解后稀释至刻度，混匀，配制成浓度为10mg/mL的内标标准储备溶液，置一20℃冰箱储存。保存期为6个月。
3.4.5内标标准中间使用液的配制：吸取1.0mL内标标准储备溶液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸稀释至刻度，混匀.作为内标使用液（1.0mg/mL），存期为3个月。3.4.6内标标准使用液的配制：吸取1.0mL内标标准中间使用液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸稀释至刻度，混，作为内标使用液（100mg/L），临用现配，4仪器和设备
高效液相色谱仪（HPLC)，配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2
组织匀质仪
离心机：转速≥6500r/min。
涡旋振荡器。
水浴装置。
氮气浓缩装置、
天平：感量分别为0.01g和0.0001g4.7
酸度计：±0.1pH。
超纯水器。
滤膜针头滤器：0.22μm。
5分析步骤
5.1水产品和肉类
5.1.1试样制备
取水产品及肉类样品的可食部分约500g，充分匀质，均分成两份装人洁净容器中，密封.于一20℃保存。
5.1.2提取
准确称取已经绞碎或匀浆后的水产品、肉类10g（精确至0.01g），置于100mL具塞锥形瓶中，加人500μL内标使用液（1.0mg/mL）与样品充分混匀，加入20mL5%三氯乙酸溶液和振荡提取30min，转移至50mL具塞离心管中，5000r/min离心10min，转移上清液至50mL容量瓶中，残渣用20mL3
5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀释至刻度，待净化。5.1.3净化
GB5009.208—2016
5.1.3.1除脂肪：移取上述试样提取液10mL于25mL具塞试管中，加人0.5g氯化钠涡旋振荡至氯化钠完全溶解后加入10mL正已烷，涡旋振荡5min，静置分层后奔去上层有机相，下层试样溶液加人10ml正已烧再除脂一次。
5.1.3.2萃取：移取5mL上述除脂肪后的试样溶液于10ml具塞离心管中，用5mol/L氢氧化钠溶液（几滴）调节pH至12.0左右。加入5mL的正丁醇/三氯甲烷（1十1）混合溶液，涡旋振荡5min，5000r/min离心5min，转移上层有机相于另一个10mL具塞离心管中，下层样液再萃取一次，合并萃取液，用正丁醇/三氯甲烷（1十1)稀释至刻度。取5mL萃取液加入200μL盐酸（1mol/L）.混匀后40℃水浴下氮气吹干，加入1mL盐酸（0.1mol/L）涡旋振荡，使残留物完全溶解，待衍生。5.1.4衍生
5.1.4.1试样的衍生：在上述待衍生的试样溶液中依次加入1mIL饱和碳酸氢钠溶液、100μL氢氧化钠溶液（1mol/L）、1mL衍生试剂，涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴中衍生15min，取出，分加人100uL谷氨酸钠溶液，振荡混匀，60℃恒温反应15min。取出.冷却至室温，于每个离心管中加入1mL水，涡旋混合1min，40℃水浴下氮吹除去丙酮（约1mL），加人0.5g氯化钠涡旋振荡至氯化钠完全溶解后加入5mL乙醚，涡旋振荡2min，静置分层后，吸出上层有机相（乙醚层），再萃取一次，合并乙醚萃取液，40℃水浴下氮气吹干。加人1mL乙腈涡旋振荡使残留物完全溶解0.22um滤膜针头滤器过滤于进样小瓶，待测定。
5.1.4.2标准的衍生：分别移取1mL生物胺标准系列溶液，置于10mL具塞试管中，依次加入250μL内标使用液（100mg/L），以下操作同试样的衍生步骤。5.2酒类及调味品（醋和酱油）
5.2.1试样的衍生：准确量取1.0mL样品于15ml塑料离心管中，依次加人250μL内标溶液（100mg/L）、1mL饱和碳酸氢钠溶液、100uL氢氧化钠溶液（1mol/L）、1mL衍生试剂，涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴锅中衍生15min，取出，分别加人100μL谷氨酸钠溶液，振荡混匀，60℃恒温反应15min，取出冷却至室温，于每个离心管中加人1mL超纯水，涡旋混合1min，40℃水浴下氮吹除去丙酮（约1mL），加人0.5g氯化钠涡旋振荡至完全溶解，再加人5mL乙醚，涡旋振荡2min，静置分层后，转移上层有机相（乙醚层）于15mL离心管中，水相（下层）再萃取一次，合并两次乙醚萃取液，40℃水浴下氮气吹干。加人1mL乙睛振荡混匀，使残留物溶解，0.22um滤膜针头滤器过滤，待测定5.2.2标准的衍生：同5.1.4.2。5.3液相色谱参考条件www.bzxz.net
色谱柱为Cls柱（柱长250mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm），紫外检测波长254nm，进样量20uL，柱温35℃，流动相A为90%乙睛/10%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液），流动相B为10%乙睛/90%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液），流速0.8mL/min。梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序表
流动相A/%
流动相B/%
时间/min
5.4标准曲线的制作
GB5009.208—2016
将20L系列混合标准工作液的衍生液分别注人高效液相色谱仪，测得目标化合物的峰面积，以系列混合标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物的峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。标准溶液的色谱图见图A.1。5.5试样溶液的测定
将试样的衍生溶液注人高效液相色谱仪中，测得峰面积，以保留时间定性。根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度。
6分析结果的表述
试样中生物胺含量按式（1)计算：式中：
X=cxVxJ
X一试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；一试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每升（mg/L)；试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；f
稀释倍数；
试样的质量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
8.1检出限
.（1)
酒类及醋：β-苯乙胺2mg/L、腐胺2mg/L、尸胺2mg/L、组胺2mg/L、酪胺2mg/L、章鱼胺5mg/L色胺5mg/L、亚精胺5mg/L、精胺5mg/L。水产品及肉类：色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、章鱼胺、酪胺、精胺和亚精胺均为20mg/kg8.2定量限
酒类及醋：β-苯乙胺5mg/L、腐胺5mg/L、尸胺5mg/L、组胺5mg/L、酪胺5mg/L、章鱼胺10mg/L、色胺10mg/L、亚精胺mg/L、精胺10mg/L。水产品及肉类：色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、章鱼胺、酪胺、精胺和亚精胺均为50mg/kg。第二法
分光光度法
9范围
本标准规定了水产品中组胺含量的测定方法5
本标准适用于水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）中组胺的测定。10原理
GB5009.208—2016
以三氯乙酸为提取溶液，振摇提取，经正戊醇萃取净化，组胺与偶氮试剂发生显色反应后，分光光度计检测，外标法定量。
11试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水11.1标准及试剂
磷酸组胺(C,HN,·2H,PO)。
正戊醇（CHzO)。
三氯乙酸（C,HClO,)。
碳酸钠（Na,CO，）。
氢氧化钠（NaOH)。
盐酸（HCI,37%）。
对硝基苯胺（CHN,O2)。
亚硝酸钠（NaNO）。
11.2试剂配制
组胺标准储备液：在100℃（士5℃）下将磷酸组胺标准干燥2h后，称取0.2767g（精确至0.001g）于50mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。此溶液每毫升相当于1.0mg组胺。置一20℃冰箱储存。保存期为6个月，11.2.2磷酸组胺标准使用液：吸取1.0mL组胺标准溶液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度。此溶液每毫升相当于20.0ug组胺。临用现配。11.2.3100g/L三氯乙酸溶液：称取50g三氯乙酸于250mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至500mL容量瓶中，定容至刻度。保存期为6个月。11.2.450g/L碳酸钠溶液：称取5g碳酸钠于100mL烧杯中用适量水完全溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。保存期为6个月。11.2.5250g/L氢氧化钠溶液：称取25g氢氧化钠于100mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。保存期为3个月5（1+11)盐酸溶液：吸取5mL盐酸于100mL烧杯中，加水55mL，混匀。保存期为6个月。11.2.6
11.2.7偶氮试剂：
甲液（对硝基苯胺）：称取0.5g对硝基苯胺，加5mL盐酸溶液溶解后，再加水稀释至200mL.置冰箱中，临用现配。
乙液（亚硝酸钠溶液）：称取0.5g亚硝酸钠，加入100mL水溶解混匀，临用现配。吸取5mL甲液，40mL乙液混合即为偶氮试剂.临用现配6
2分析步骤
12.1试样制备
GB5009.208—2016
取鲜活水产品的可食部分约500g代表性样品.用组织捣碎机充分捣碎，均分成两份分别装入洁净容器中，密封，并标明标记。一20℃保存。12.2试样的分析
12.2.1试样提取
准确称取已经绞碎均匀的试样10g（精确至0.01g），置于100mL具塞锥形瓶中，加人20mL10%三氯乙酸溶液浸泡2h~3h，振荡2min混匀，滤纸过滤，准确吸取2.0mL滤液于分液漏斗中，逐滴加人氢氧化钠溶液调节pH在10～12之间，加人3mL正戊醇振摇提取5min，静置分层，将正戊醇提取液（上层）转移至10mL刻度试管中。正戊醇提取三次，合并提取液，并用正戊醇稀释至刻度。吸取2.0mL正戊醇提取液于分液漏斗中，加人3mL盐酸溶液振摇提取，静置分层，将盐酸提取液（下层）转移至10mL刻度试管中。提取三次，合并提取液，并用盐酸溶液稀释至刻度。12.2.2测定
分别吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL组胺标准使用液（相当于0、4.0、8.0、12、16、20μg组胺）及2.0mL试样提取液于10mL比色管中，加水至1mL，再加入1mL盐酸溶液，混匀。加人3mL碳酸钠溶液，3mL偶氮试剂。加水至刻度，混匀，放置10min。将\o”管溶液转移至1cm比色Ⅲ，分光光度计波长调至480nm，调节吸光度为0\后，依次测试系列标准溶液及试样溶液吸光度，以吸光度A为纵轴，组胺的质量为横轴绘制标准曲线，13结果计算
试样中组胺的含量按式(2)计算：X=m/V/×10×10
mzX2X2X2
式中：
试样中组胺的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样中组胺的吸光度值对应的组胺质量，单位为微克（ug)；加人三氯乙酸溶液的体积，单位为毫升（mL）；.(2)
第一个是正戊醇提取液的体积，单位为毫升（mL）；第二个是盐酸提取液的体积，单位为毫升（mL）；
取样量，单位为克（g）；
第一个是三录乙酸提取液的体积，单位为毫升（mL）；第二个是正戊醇提取液的体积，单位为毫升（mL）；第三个是盐酸提取液的体积，单位为毫升（mL）；100
换算系数；
1000—换算系数。
计算结果保留小数点后一位。
14精密度
GB 5009.208—2016
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15
方法定量限：组胺50mg/kg。
9种生物胺标准溶液及内标衍生物液相色谱图9种生物胺标准溶液及内标衍生物液相色谱图见图A.1。At.
9种生物胺标准溶液及内标衍生物液相色谱图图A.1
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食品安全国家标准
食品中生物胺的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.208—2016
本标准代替GB/T5009.208—2008《食品中生物胺含量的测定》、GB/T20768—2006《鱼和虾中有毒生物胺的测定液相色谱-紫外检测法》、SN/T2209一2008《进出口水产品中有毒生物胺的检测方法高效液相色谱法》，及GB/T5009.45一2003《水产品卫生标准的分析方法》中组胺检测部分。本标准与GB/T5009.208—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中生物胺的测定”；—增加了分光光度法；
——增加了章鱼胺；
修改了酒类和醋酱油的测定；
修改了流动相和洗脱梯度；
修改了样品前处理方法；
适用范围删除了乳制品。
1范围
食品安全国家标准
食品中生物胺的测定
液相色谱法
第一法
GB5009.208—2016
本标准规定了食品中色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、章鱼胺、酪胺、亚精胺和精胺含量的测定方法。
本标准适用于酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒等）、调味品（醋和酱油）、水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）、肉类中生物胺的测定。
水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）、肉类：试样用5%三氯乙酸提取，正已烷去除脂肪，三氯甲烷-正丁醇（1十1)液液萃取净化后，丹磺酰氯衍生，C1：色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。
酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒等）、调味品（醋和酱油）：试样用丹磺酰氯衍生，C1色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，内标法定量。试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，3.1试剂
乙腈（CHCN）：色谱纯。
丙酮（C,H.O)：色谱纯。
乙醚（CHi.O)：重蒸。
正丁醇(C,H.O)。
三氯甲烷（CHCI）。
正已烷（C,Hi4）：色谱纯
乙酸(CHCOOH)：色谱纯
乙酸铵（CH.COONH）：色谱纯
谷氨酸钠（CHNNaO,）。
碳酸氢钠（NaHCO）。
氯化钠(NaCI)。
氢氧化钠(NaOH)。
盐酸（HC1,37%）。
三氯乙酸（C,HCl,O,）。
GB5009.208—2016
3.1.15丹磺酰氯（Dansylchloride.C12Hi2CINO,S.CAS号：605-65-2，纯度>99%）。3.2试剂配制
3.2.1丹磺酰氯衍生剂溶液：准确称取丹磺酰氯适量，以丙酮为溶剂配制浓度为10mg/mL.的衍生剂使用液，置4℃冰箱避光储存。
3.2.25%三氯乙酸溶液：准确称取25g三氯乙酸于250mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至500mL容量瓶中.定容至刻度。
3.2.31mol/L盐酸溶液：准确量取8.6mL盐酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。3.2.40.1mol/L盐酸溶液：准确量取1mol/L盐酸溶液10mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3.2.51mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加入100mL水完全溶解。3.2.6正丁醇/三氯甲烷（1十1)混合溶液：分别量取相同体积的正丁醇和三氯甲烷混合均匀即可。3.2.7饱和碳酸氢钠溶液：称取15g碳酸氢钠，加人100mL水溶解，取上清液即为饱和溶液，3.2.8
50mg/mL谷氨酸钠溶液：准确称取5.0g谷氨酸钠用饱和碳酸氢钠溶液溶解并定容至100mL3.2.9含1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液：称取0.77g乙酸铵溶解于水中，转移至1000mL容量瓶中，加入10mL甲酸，用水定容至刻度。3.2.10
流动相A：量取100mL含1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液加入900mL乙腈。3.2.11流动相B：量取900mL含1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液于加人100mL乙睛。3.3标准品
组胺盐酸盐（Histaminedihydrochloride，C,H,N2HCl，CAS号：56-92-8）标准品（纯度>99%）。
3.3.2β-苯乙胺盐酸盐（β-phenylethylaminehydrochloride，C.HiN·HCl，CAS号：64-04-0）标准品（纯度>98%）。
酪胺盐酸盐（Tyraminehydrochloride，CHnNO·HCl，CAS号：60-19-5）标准品（纯度3.3.3
>98%）
3.3.4腐胺盐酸盐（Putreseinedihydrochloride，C,Hi2Nz·2HCl，CAS号：333-93-7）标准品（纯度>98%）。
3.3.5胺盐酸盐（Cadaverinedihydrochloride，C,HN，·2HCl,CAS号：1476-39-7）标准品（纯度>98%)
3.3.6色胺盐酸盐（Tryptaminehydrochloride，C1HizNz·HCl,CAS号：61-54-1）标准品（纯度>99%)。
3.3.7精胺盐酸盐（Sperminetetrahydrochloride，Ci,H26N·4HCl.CAS号：306-67-2）标准品（纯度>97%)。
3.3.8亚精胺盐酸盐（Spermidinetrihydrochloride，CH，N，·3HCl，CAS号：334-50-9）标准品（纯度>97%)。
3.3.9章鱼胺盐酸盐（Octopaminehydrochloride，CHnNOzHCl，CAS号：770-05-9）标准品（纯度>97%)。
3.3.101.7-二氨基庚烷（1，7-Diaminoheptane.C,HisNz，CAS号：646-19-5）内标标准品（纯度>98%)。
3.4标准溶液配制
注：标准溶液的配制浓度以各生物胺单体计算，称取标准品时应对其中的盐酸盐进行折算。所有标准溶液配制好2
后均需转移至密闭棕色容器申，避光贮存GB5009.208—2016
3.4.1生物胺标准储备溶液的配制：准确称取各种生物胺标准品适量，分别置于10mL小烧杯中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解后转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，配制成浓度为1000mg/L（以各种生物胺单体计的标准储备溶液，置一20℃冰箱储存。保存期为6个月。3.4.2生物胺标准混合使用液的配制：分别吸取1.0mL各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸稀释至刻度.混匀，配制成生物胺标准混合使用液（100mg/L）。保存期为3个月。
3.4.3生物胺标准系列溶液的配制：分别吸取0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL、1.50mL、2.50mL、5.0mL生物胺标准混合使用液（100mg/L），置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，使浓度分别为1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L、50.0mg/L，临用现配。
3.4.4内标标准储备溶液的配制：准确称取内标标准品适量，置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解后稀释至刻度，混匀，配制成浓度为10mg/mL的内标标准储备溶液，置一20℃冰箱储存。保存期为6个月。
3.4.5内标标准中间使用液的配制：吸取1.0mL内标标准储备溶液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸稀释至刻度，混匀.作为内标使用液（1.0mg/mL），存期为3个月。3.4.6内标标准使用液的配制：吸取1.0mL内标标准中间使用液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸稀释至刻度，混，作为内标使用液（100mg/L），临用现配，4仪器和设备
高效液相色谱仪（HPLC)，配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2
组织匀质仪
离心机：转速≥6500r/min。
涡旋振荡器。
水浴装置。
氮气浓缩装置、
天平：感量分别为0.01g和0.0001g4.7
酸度计：±0.1pH。
超纯水器。
滤膜针头滤器：0.22μm。
5分析步骤
5.1水产品和肉类
5.1.1试样制备
取水产品及肉类样品的可食部分约500g，充分匀质，均分成两份装人洁净容器中，密封.于一20℃保存。
5.1.2提取
准确称取已经绞碎或匀浆后的水产品、肉类10g（精确至0.01g），置于100mL具塞锥形瓶中，加人500μL内标使用液（1.0mg/mL）与样品充分混匀，加入20mL5%三氯乙酸溶液和振荡提取30min，转移至50mL具塞离心管中，5000r/min离心10min，转移上清液至50mL容量瓶中，残渣用20mL3
5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀释至刻度，待净化。5.1.3净化
GB5009.208—2016
5.1.3.1除脂肪：移取上述试样提取液10mL于25mL具塞试管中，加人0.5g氯化钠涡旋振荡至氯化钠完全溶解后加入10mL正已烷，涡旋振荡5min，静置分层后奔去上层有机相，下层试样溶液加人10ml正已烧再除脂一次。
5.1.3.2萃取：移取5mL上述除脂肪后的试样溶液于10ml具塞离心管中，用5mol/L氢氧化钠溶液（几滴）调节pH至12.0左右。加入5mL的正丁醇/三氯甲烷（1十1）混合溶液，涡旋振荡5min，5000r/min离心5min，转移上层有机相于另一个10mL具塞离心管中，下层样液再萃取一次，合并萃取液，用正丁醇/三氯甲烷（1十1)稀释至刻度。取5mL萃取液加入200μL盐酸（1mol/L）.混匀后40℃水浴下氮气吹干，加入1mL盐酸（0.1mol/L）涡旋振荡，使残留物完全溶解，待衍生。5.1.4衍生
5.1.4.1试样的衍生：在上述待衍生的试样溶液中依次加入1mIL饱和碳酸氢钠溶液、100μL氢氧化钠溶液（1mol/L）、1mL衍生试剂，涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴中衍生15min，取出，分加人100uL谷氨酸钠溶液，振荡混匀，60℃恒温反应15min。取出.冷却至室温，于每个离心管中加入1mL水，涡旋混合1min，40℃水浴下氮吹除去丙酮（约1mL），加人0.5g氯化钠涡旋振荡至氯化钠完全溶解后加入5mL乙醚，涡旋振荡2min，静置分层后，吸出上层有机相（乙醚层），再萃取一次，合并乙醚萃取液，40℃水浴下氮气吹干。加人1mL乙腈涡旋振荡使残留物完全溶解0.22um滤膜针头滤器过滤于进样小瓶，待测定。
5.1.4.2标准的衍生：分别移取1mL生物胺标准系列溶液，置于10mL具塞试管中，依次加入250μL内标使用液（100mg/L），以下操作同试样的衍生步骤。5.2酒类及调味品（醋和酱油）
5.2.1试样的衍生：准确量取1.0mL样品于15ml塑料离心管中，依次加人250μL内标溶液（100mg/L）、1mL饱和碳酸氢钠溶液、100uL氢氧化钠溶液（1mol/L）、1mL衍生试剂，涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴锅中衍生15min，取出，分别加人100μL谷氨酸钠溶液，振荡混匀，60℃恒温反应15min，取出冷却至室温，于每个离心管中加人1mL超纯水，涡旋混合1min，40℃水浴下氮吹除去丙酮（约1mL），加人0.5g氯化钠涡旋振荡至完全溶解，再加人5mL乙醚，涡旋振荡2min，静置分层后，转移上层有机相（乙醚层）于15mL离心管中，水相（下层）再萃取一次，合并两次乙醚萃取液，40℃水浴下氮气吹干。加人1mL乙睛振荡混匀，使残留物溶解，0.22um滤膜针头滤器过滤，待测定5.2.2标准的衍生：同5.1.4.2。5.3液相色谱参考条件www.bzxz.net
色谱柱为Cls柱（柱长250mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm），紫外检测波长254nm，进样量20uL，柱温35℃，流动相A为90%乙睛/10%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液），流动相B为10%乙睛/90%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液），流速0.8mL/min。梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序表
流动相A/%
流动相B/%
时间/min
5.4标准曲线的制作
GB5009.208—2016
将20L系列混合标准工作液的衍生液分别注人高效液相色谱仪，测得目标化合物的峰面积，以系列混合标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物的峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。标准溶液的色谱图见图A.1。5.5试样溶液的测定
将试样的衍生溶液注人高效液相色谱仪中，测得峰面积，以保留时间定性。根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度。
6分析结果的表述
试样中生物胺含量按式（1)计算：式中：
X=cxVxJ
X一试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；一试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每升（mg/L)；试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；f
稀释倍数；
试样的质量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
8.1检出限
.（1)
酒类及醋：β-苯乙胺2mg/L、腐胺2mg/L、尸胺2mg/L、组胺2mg/L、酪胺2mg/L、章鱼胺5mg/L色胺5mg/L、亚精胺5mg/L、精胺5mg/L。水产品及肉类：色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、章鱼胺、酪胺、精胺和亚精胺均为20mg/kg8.2定量限
酒类及醋：β-苯乙胺5mg/L、腐胺5mg/L、尸胺5mg/L、组胺5mg/L、酪胺5mg/L、章鱼胺10mg/L、色胺10mg/L、亚精胺mg/L、精胺10mg/L。水产品及肉类：色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、章鱼胺、酪胺、精胺和亚精胺均为50mg/kg。第二法
分光光度法
9范围
本标准规定了水产品中组胺含量的测定方法5
本标准适用于水产品（鱼类及其制品、虾类及其制品）中组胺的测定。10原理
GB5009.208—2016
以三氯乙酸为提取溶液，振摇提取，经正戊醇萃取净化，组胺与偶氮试剂发生显色反应后，分光光度计检测，外标法定量。
11试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水11.1标准及试剂
磷酸组胺(C,HN,·2H,PO)。
正戊醇（CHzO)。
三氯乙酸（C,HClO,)。
碳酸钠（Na,CO，）。
氢氧化钠（NaOH)。
盐酸（HCI,37%）。
对硝基苯胺（CHN,O2)。
亚硝酸钠（NaNO）。
11.2试剂配制
组胺标准储备液：在100℃（士5℃）下将磷酸组胺标准干燥2h后，称取0.2767g（精确至0.001g）于50mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。此溶液每毫升相当于1.0mg组胺。置一20℃冰箱储存。保存期为6个月，11.2.2磷酸组胺标准使用液：吸取1.0mL组胺标准溶液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度。此溶液每毫升相当于20.0ug组胺。临用现配。11.2.3100g/L三氯乙酸溶液：称取50g三氯乙酸于250mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至500mL容量瓶中，定容至刻度。保存期为6个月。11.2.450g/L碳酸钠溶液：称取5g碳酸钠于100mL烧杯中用适量水完全溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。保存期为6个月。11.2.5250g/L氢氧化钠溶液：称取25g氢氧化钠于100mL烧杯中，用适量水完全溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。保存期为3个月5（1+11)盐酸溶液：吸取5mL盐酸于100mL烧杯中，加水55mL，混匀。保存期为6个月。11.2.6
11.2.7偶氮试剂：
甲液（对硝基苯胺）：称取0.5g对硝基苯胺，加5mL盐酸溶液溶解后，再加水稀释至200mL.置冰箱中，临用现配。
乙液（亚硝酸钠溶液）：称取0.5g亚硝酸钠，加入100mL水溶解混匀，临用现配。吸取5mL甲液，40mL乙液混合即为偶氮试剂.临用现配6
2分析步骤
12.1试样制备
GB5009.208—2016
取鲜活水产品的可食部分约500g代表性样品.用组织捣碎机充分捣碎，均分成两份分别装入洁净容器中，密封，并标明标记。一20℃保存。12.2试样的分析
12.2.1试样提取
准确称取已经绞碎均匀的试样10g（精确至0.01g），置于100mL具塞锥形瓶中，加人20mL10%三氯乙酸溶液浸泡2h~3h，振荡2min混匀，滤纸过滤，准确吸取2.0mL滤液于分液漏斗中，逐滴加人氢氧化钠溶液调节pH在10～12之间，加人3mL正戊醇振摇提取5min，静置分层，将正戊醇提取液（上层）转移至10mL刻度试管中。正戊醇提取三次，合并提取液，并用正戊醇稀释至刻度。吸取2.0mL正戊醇提取液于分液漏斗中，加人3mL盐酸溶液振摇提取，静置分层，将盐酸提取液（下层）转移至10mL刻度试管中。提取三次，合并提取液，并用盐酸溶液稀释至刻度。12.2.2测定
分别吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL组胺标准使用液（相当于0、4.0、8.0、12、16、20μg组胺）及2.0mL试样提取液于10mL比色管中，加水至1mL，再加入1mL盐酸溶液，混匀。加人3mL碳酸钠溶液，3mL偶氮试剂。加水至刻度，混匀，放置10min。将\o”管溶液转移至1cm比色Ⅲ，分光光度计波长调至480nm，调节吸光度为0\后，依次测试系列标准溶液及试样溶液吸光度，以吸光度A为纵轴，组胺的质量为横轴绘制标准曲线，13结果计算
试样中组胺的含量按式(2)计算：X=m/V/×10×10
mzX2X2X2
式中：
试样中组胺的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样中组胺的吸光度值对应的组胺质量，单位为微克（ug)；加人三氯乙酸溶液的体积，单位为毫升（mL）；.(2)
第一个是正戊醇提取液的体积，单位为毫升（mL）；第二个是盐酸提取液的体积，单位为毫升（mL）；
取样量，单位为克（g）；
第一个是三录乙酸提取液的体积，单位为毫升（mL）；第二个是正戊醇提取液的体积，单位为毫升（mL）；第三个是盐酸提取液的体积，单位为毫升（mL）；100
换算系数；
1000—换算系数。
计算结果保留小数点后一位。
14精密度
GB 5009.208—2016
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15
方法定量限：组胺50mg/kg。
9种生物胺标准溶液及内标衍生物液相色谱图9种生物胺标准溶液及内标衍生物液相色谱图见图A.1。At.
9种生物胺标准溶液及内标衍生物液相色谱图图A.1
GB5009.208—2016
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