GB 5009.213-2016
基本信息
标准号： GB 5009.213-2016
中文名称：食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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标准简介
GB 5009.213-2016 食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定
GB5009.213-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.213—2016
食品安全国家标准
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB 5009.213—2016
本标准代替GB/T5009.213—2008《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》、GB/T23215—2008《贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法》、SC/T3023一2004《麻痹性贝类毒素的测定生物法》、SN0352—1995《出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法》、SN/T1735—2006《进出口贝类产品中麻痹性贝类毒素检验方法高效液相色谱法》和SN/T1773一2006《进出口贝类中麻痹性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附试验法》。本标准与GB/T5009.213—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定”；增加了酶联免疫吸附法；
增加了液相色谱-串联质谱法。
1范围
食品安全国家标准
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
GB5009.213—2016
本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素测定的小鼠生物法，酶联免疫吸附方法，液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。
本标准适用于牡蛎、扇贝等贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的检测小鼠生物法
2原理
用盐酸提取贝类中麻痹性贝类毒素（PSP）。记录小鼠腹腔注射提取液后的死亡时间，根据麻痹性贝类毒素致小鼠死亡时间与鼠单位关系的对照表查出鼠单位（MU)，并按小鼠体重对鼠单位进行校正得到校正鼠单位（CMU），计算得到每100g样品中PSP的鼠单位。以石房蛤毒素作为标准，将鼠单位换算成毒素的微克数，计算每100g贝肉中的PSP微克数。测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素总量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
3.1.1氢氧化钠(NaOH)。
3.1.2盐酸（HCI）。
3.1.3无水乙醇（CH.CHOH)。
3.2试剂配制
氢氧化钠溶液（0.1mol/L)：将4.0g氢氧化钠溶于1L水中。3.2.1
3.2.2盐酸溶液（0.18mol/L)：将15.5mL盐酸用蒸馏水稀释至1L。3.2.3盐酸溶液（5mol/L）：将45mL盐酸用水稀释至100mL。3.2.4酸性乙醇溶液：量取无水乙醇200mL用水稀释至1000mL，混匀.用盐酸溶液（5mol/L）调节pH至2.0~4.0。
3.3标准品
石房蛤毒素标准品（STX.C1.H1-N，O，：2HCI，CAS号35554-08-6）：纯度≥98.0%3.4标准溶液的配制
3.4.1石房蛤毒素标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量STX标准品，用酸性乙醇溶液溶解并定容1
配制成STX的质量浓度为100ug/mL的标准储备液GB5009.213—2016
3.4.2石房蛤毒素标准工作液（1μg/mL）：准确吸取1mlL石房蛤毒素标准储备液（100μg/mL），用水稀释，用盐酸溶液（5mol/L）调节pH至2.0～4.0.用水定容至100mL。该标准工作液于0℃～4℃下可保存30d。
3.5材料
3.5.1小鼠：体重为19g～21g的健康ICR系雄性小鼠。3.5.2pH计或pH试纸。
4仪器和设备
均质器。
4.2分析天平：感量为0.1g和0.0001g。4.3离心机：转速2000r/min。
5分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液管及移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在次氯酸钠溶液（5%）中浸泡1h以上以使毒素分解。对于动物实验过程中产生的污水、废弃物及动物户体处理，应参照GB14925执行。
5.1样品采集
从2kg以上样品中采取足够贝类个数，去壳使贝肉达200g以上。不能及时送检的新鲜贝类，开壳将贝肉分离，将沥水后的200g贝肉放人200mL盐酸溶液（0.18mol/L)中，置4℃保存，备检。5.2试样制备
5.2.1牡蛎、蛤及贻贝
用清水将贝类样品外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破贝体。严禁加热或用麻醉剂开壳。收集约200g贝肉分散置于筛子中沥水5min（不要使肉堆积），捡出碎壳等杂物，将贝肉均质备用5.2.2扇贝
取可食部分用作检测，按5.2.1均质后备用。5.2.3冷冻贝类
在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）自然融化，按5.2.1开壳、淋洗、取肉、均质、备用。5.2.4贝类罐头
将罐内所有内容物（肉及液体)充分均质。如果是大罐，将贝肉沥水并收集沥下的液体分别称重并存放固形物和汤汁，将固形物和汤汁按原罐装比例混合，均质后备用，5.2.5用酸保存的贝肉
沥去酸液，分别存放贝肉及酸液备用。2
5.2.6贝肉干制品
GB5009.213—2016
干制品可于等体积盐酸溶液（0.18mol/L)中浸泡24h～48h(4℃冷藏），沥去酸液，分别存放贝肉及酸液备用。
5.3PSP标准品对照试验
5.3.1PSP标准工作液的配制
用10mL、15mL、20mL、25mL和30mL水分别稀释10mL石房蛤毒素标准工作液，配制成系列浓度的标准稀释液。
5.3.2中位数死亡时间的PSP标准工作液选择取按5.3.1配制的系列浓度的标准稀释液各1mL，腹腔注射小鼠数只，选择中位数死亡时间为5min～7min的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求，还需以1mL水的增减量进行补充稀释试验每只小鼠试验前称重，以10只小鼠为一组，用中位数死亡时间在5min～7min范围内的两个浓度的标准稀释液注射小鼠，测定并记录每只小鼠腹腔注射完毕至停正呼吸的所需死亡时间5.3.3毒素转换系数(CF)的计算
5.3.3.1小鼠中位数死亡时间的选择计算5.3.2中所选择浓度的标准稀释液受试组的中位数死亡时间。弃去中位数死亡时间小于5min或大于7min的受试组；选择中位数死亡时间在5min～7min的受试组，该受试组中可允许有个别小鼠的死亡时间可小于5min或大于7min。5.3.3.2校正鼠单位（CMU)的计算对于所选定的中位数死亡时间为5min～7min的受试组，根据附录A查得该组中每只小鼠死亡时间所对应的鼠单位（MU），再根据附录B查得组中每只小鼠体重所对应的体重校正系数，同一只小鼠的体重校正系数与鼠单位相乘得到该只受试小鼠的校正鼠单位（CMU）。5.3.3.3毒素转换系数(CF)的计算单只小鼠的毒素转换系数（CF)按式(1)计算：CF=CMU
式中：bzxZ.net
CF—毒素转换系数，单位为微克每毫升（μg/mL）；——每毫升STX标准稀释液中的毒素含量，单位为微克每毫升（μg/mL）CMU-—校正鼠单位。
得到单只小鼠的毒素转换系数（CF)后，再计算每组10只小鼠的平均CF值，即为组内毒素转换系数（CF,）。
5.3.3.4组间毒素转换系数（CF,)的计算取不同受试组的组内毒素转换系数的平均值，即为组间毒素转换系数（CF，）。以组间毒素转换系数进行试样毒力的计算。
5.3.3.5CF值定期检查
GB5009.213—2016
如PSP检测间隔时间较长，每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小鼠，重新测定CF值。如果一周有几次检测，则用中位数死亡时间5min～7min的标准稀释液每周检查一次，测得的CF值应在原测定CF值的土20%范围内。若结果不符，则用同样的标准稀释液另外注射5只小鼠，综合之前注射的5只小鼠的结果，计算出CF值。并用同样的标准稀释液注射第二组10只小鼠，将第二组求出的CF值和第一组的CF值进行平均，即为一个新的CF值。重复检查的CF值通常在原结果的土20%之内，若经常发现有较大偏差，在进行常规检测前应调查该方法中是否存在可变影响因素。5.4试样提取
取100g试样于烧杯中，加盐酸溶液（0.18mol/L)100ml充分搅拌，均质，调节pH至2.0~4.0，必要时，可逐滴加入盐酸溶液（5mol/L)或氢氧化钠溶液（0.1mol/L)调节pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。将混合物加热煮沸5min，冷却至室温，移至量筒中并稀释至200mL：调节pH至2.0～4.0。
将混合物倒回烧杯，搅拌均匀，自然沉降至上清液呈半透明状，不堵塞注射针头即可，必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min，或用滤纸过滤。收集上清液备用。5.5小鼠试验
取19.0g～21.0g健康ICR雄性小鼠6只，称重并记录重量。随机分为实验组和空白对照组两组，每组3只。
对每只实验组小鼠腹腔注射1mL试样提取液，对每只空白对照组腹腔注射1mL盐酸溶液(0.18mol/L）。注射过程中若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射完毕时间，仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间（到小鼠呼出最后一口气止）。若注射试样提取液后，1只或2只小鼠的死亡时间大于7min，需再注射至少三只小鼠。若小鼠的死亡时间小于5min，稀释试样提取液后，再注射3只小鼠，直至小鼠在5min～7min内死亡；稀释试样提取液时，需逐滴加人盐酸溶液（0.18mol/L)调节pH至2.0～4.0。6分析结果的表述
6.1以质量分数计的PSP毒力的计算与结果表述6.1.1以质量分数计的PSP毒力的计算每100g试样中PSP的含量按式（2)计算：X=CMU, XCF XDF X200
式中：
每100g样品中PSP的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；CMU
试样受试组小鼠的中位数校正鼠单位；CF,
组间毒素转换系数，单位为微克每毫升（μg/mL)；稀释倍数；
试样提取液的体积，单位为毫升（mL）。（2）
注：根据检测样品受试组的小鼠死亡时间，查出附录A对应的鼠单位；根据附录B查出小鼠体重所对应的体重校正系数，两者相乘得到该只小鼠的CMU。选取受试组中3只小鼠CMU的中位数，即为CMU1。4
6.1.2以质量分数计的PSP毒力的结果表述GB 5009.213—2016
若空白对照组小鼠正常，则报告待测样品中PSP毒素含量为：XX×μg/100g。6.2以MU计的PSP毒力的计算与结果表述6.2.1以MU计的PSP毒力的计算
每100g试样中以MU计的PSP毒力按式（3计算：Y=CMUXDFX200
式中：
每100g样品的MU值，单位为鼠单位每百克（MU/100g）；CMU,
实验组小鼠的中位数校正鼠毒力单位；DF
稀释倍数；
试样提取液的体积，单位为毫升（mL）。注：对于取得PSP标准品有困难的实验室，可按式（3)计算以MU计的PSP毒力。6.2.2
以MU计的PSP毒力的判断与结果表述在空白对照组小鼠正常的情况下进行如下判断和表述：·（3）
若实验组中位数死亡时间小于5min，则应对样品提取液进行稀释，再选取3只小鼠进行试验，直至得到中位数死亡时间为5min～7min为正，根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位毒力为：X××MU/100g。若实验组中位数死广时间天于7min，则直接计算确定样品鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位毒力为：×××MU/100g。
若实验组中所有小鼠在观察15min内均不死亡，可报告该样品的鼠单位毒力小于400MU/100g。酶联免疫吸附法
7原理
游离麻痹性贝类毒素与其酶标记物竞争麻痹性贝类毒素抗体，同时麻痹性贝类毒素抗体与捕提抗体连接。没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。用酶标仪在450nm波长下测量微孔溶液的吸光度值，试样中麻痹性贝类毒素含量与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。8试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水8.1试剂
8.1.1盐酸(HCI)。
8.1.2十二水合磷酸氢二钠（NazHPO,·12H2O）。8.1.3氯化钠(NaCI)。
8.1.4氯化钾（KCI)。
8.1.5磷酸二氢钾（KH,PO,)。
8.1.6吐温-20（CsHi,O26）。
8.1.7牛血清白蛋白（BSA)。
8.1.8酶标记物。
8.1.9麻痹性贝类毒素抗体。
过氧化氢（H,O2）。
3.3,5,5-四甲基联苯胺（TMBCH2N,）。硫酸（H,SO,)。
试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：量取9mL盐酸，用水稀释至1000mL。8.2.2
盐酸溶液（5mol/L）：量取450mL盐酸，用水稀释至1000mL。GB5009.213—2016
8.2.3磷酸盐缓冲液（PBS溶液，pH7.4）：分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯化钾0.20g.加水溶解并定容至1000mL。8.2.4抗体稀释液：称取1.0gBSA，加PBS溶液溶解并定容至1000mL。8.2.5酶标记物工作液：用抗体稀释液将酶标记物稀释至工作浓度8.2.6麻痹性贝类毒素抗体工作液：麻痹性贝类毒素抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度8.2.7洗脱液：吸取0.5mL吐温-20，用PBS溶液稀释至1000mL。8.2.8硫酸溶液（1mol/L）：吸取53.2mL硫酸，缓缓加至盛有500mL水的烧杯中，并用水定容至1000mL，混匀。
8.3标准品
石房蛤毒素（STX.CiHi,N,O42HCICAS号35554-08-6）标准溶液8.4
标准溶液配制
标准系列工作液配制：准确吸取适量体积的石房蛤毒素标准溶液用PBS溶液（pH7.4）稀释.配制成质量浓度分别为0μg/L，2.5uμg/L.5μg/L，10μg/L.20μg/L，40μg/L的标准系列工作液。现用现配。
8.5材料
包被有麻痹性贝类毒素捕提抗体的微孔板注：商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准，参见附录C。9仪器和设备
9.1酶标仪。
9.2均质器。
离心机：转速6000r/min。
分析步骤
10.1样品采集
同5.1。
10.2试样制备
同5.2。
10.3试样提取
GB5009.213—2016
称取10g（精确至0.1g）试样，加入70mL盐酸溶液（0.1mol/L)如为较干燥的贝肉，加人140mL盐酸溶液（0.1mol/L），煮沸并搅拌5min4℃条件下6000r/min离心10min，上清液用盐酸溶液（5mol/L）调节pH至4.0以下。取100μL提取液，加人900μLPBS溶液（pH7.4）.混匀，取50μL进行测定。
10.4测定
将包被有麻痹性贝类毒素捕捉抗体的微孔条插人微孔架并做好标记，其中包括空白对照孔、标准液孔和样液孔，分别做平行孔。向空白对照孔加入50uL磷酸盐缓冲液，标准液孔加入50μL麻痹性贝类毒素标准系列工作液，样液孔加人50uL样液。加入50μL麻痹性贝类毒素酶标记物至每个微孔，轻轻混合；再加人50uL麻痹性贝类毒素抗体至每个微孔，彻底混合，用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发，20℃～25℃黑暗避光处孵育15min。孵育结束后，倒去孔中液体，每个微孔注入250uL洗脱液冲洗，翻转微孔板，倾去孔内液体，再重复以上洗板操作5次，在吸水纸上拍干。每孔加100uL过氧化氢和TMB.充分混合.20C～~25℃黑暗避光处孵育15min。每孔加人100uL硫酸溶液（1mol/L）迅速混匀，终止反应，在10min内测量并记录450nm波长下的吸光度值。若测定的样液的质量浓度超出标准曲线的线性范围，可扩天稀释倍数后重新进行测定。10.5标准曲线的制作
以麻痹性贝类毒素标准系列工作液质量浓度以10为底的对数值为横坐标，以式（4)计算的百分比吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，麻痹性贝类毒素标准液和样液的百分比吸光度值按式（4）计算：s
A-s。
×100%
式中：
一百分比吸光度值；
麻痹性贝类毒素标准液或样液的平均吸光度值；-0ug/kg的麻痹性贝类毒素标准液的平均吸光度值。So
11分析结果的表述
试样中麻痹性贝类毒素的含量按式（5)计算：X=pxvxf
式中：
X—试样中麻痹性贝类毒素的含量，单位为微克每克（μug/g)；p
.（4)
··（5）
由标准曲线得到的试样待测液中麻痹性贝类毒素的质量浓度，单位为微克每毫升（pμg/mL）；试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；稀释倍数：
试样的质量，单位为克（g）。
注：任何麻痹性贝类毒素含量值大于800ug/kg的样品即被认为是有害的，对人类食用不安全。7
2其他
本方法的定量限为50ug/kg。
13原理
液相色谱法
GB 5009.213—2016
试样中的麻痹性贝类毒素经盐酸溶液（0.1mol/L)提取.C1固相萃取柱和超滤离心净化，液相色谱分离，在线柱后衍生荧光检测，外标法定量。14
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。14.1试剂
乙腈（CH.CN）：色谱纯。
无水乙酸(CH,COOH)。
盐酸（HCI)。
庚烷磺酸钠（C,HisNaO,S)。
磷酸(HPO,）。
二水合高碘酸（HIO，·2H2O)。磷酸氢二钾（K,HPO,）。
氢氧化钾(KOH)。
氨水(NH·H,O)。
试剂配制
庚烷磺酸钠溶液（0.1mol/L）：称取20.2g庚烷磺酸钠，用水溶解并稀释至1000mL。磷酸溶液（0.5mol/L）：称取49.0g磷酸，用水溶解并稀释至1000mL。磷酸氢二钾溶液（0.25mol/L）：称取43.5g磷酸氢二钾，用水溶解并稀释至1000mL氢氧化钾溶液（1mol/L）：称取56.1g氢氧化钾，用水溶解并稀释至1000mL。高碘酸溶液（0.5mol/L）：称取114.0g二水合高碘酸，用水溶解并稀释至1000mL。乙酸溶液（1mol/L）：称取60.0g无水乙酸，用水溶解并稀释至1000mL。乙酸溶液（0.01mol/L）：量取10.0mL乙酸溶液（1mol/L），用水稀释至1000mL。盐酸溶液（0.1mol/L)：量取9.0mL盐酸，用水稀释至1000mL。流动相A：量取15.0mL庚烷磺酸钠溶液（0.1mol/L）、8.5mL磷酸溶液（0.5mol/L），用约450mL水稀释，用氨水调pH至7.2，用水定容至500mL，过0.45μm水相微孔滤膜流动相B：量取20.0mL庚烷磺酸钠溶液（0.1mol/L）、45.0mL磷酸溶液（0.5mol/L），用约14.2.10
450mL水稀释.用氨水调节pH至7.2.用水定容到500mL.过0.45μm水相微孔滤膜。14.2.11
氧化液：量取10.0mL高碘酸（0.5mol/L）、100mL磷酸氢二钾溶液（0.25mol/L），用约450mL水溶解，用氢氧化钾溶液（1mol/L）调节pH至9.0，用水稀释至500mL。8
14.3标准品
GB5009.213—2016
麻痹性贝类毒素GTX1，4、GTX2，3、dcGTX2，3、GTX5、neoSTX、STX、dcSTX标准溶液，避光保存于一20℃以下。标准品相关信息参见附录D。14.4标准溶液配制
14.4.1麻痹性贝类毒素标准储备液：准确吸取适量麻痹性贝类毒素标准溶液，用乙酸溶液（0.01mol/L）稀释并定容，配制成一定浓度的标准储备液，避光保存于一20℃以下。14.4.2麻痹性贝类毒素混合标准溶液：分别准确吸取适量各麻痹性贝类毒素标准储备液，用乙酸溶液(0.01mol/L)稀释并定容，配制成所需质量浓度的混合标准溶液.现用现配。3麻痹性贝类毒素混合标准工作液：准确吸取适量麻痹性贝类毒素混合标准溶液，用乙酸溶液14.4.3
（0.01mol/L）稀释并定容，配制成混合标准工作液，相关信息见附录D。14.5材料
Cl：固相萃取柱：500mg/3mL，或性能相当者。使用前依次用6mL甲醇和6mL水活化14.5.2
超滤离心管：4mL，10KD。
微孔滤膜：0.45um，水相，
仪器和设备
液相色谱仪：配有荧光检测器，柱后衍生反应装置离心机：转速≥2000r/min。
固相萃取装置。
涡旋振荡器
恒温水浴锅。
pH计。
分析步骤
样品采集
同5.1。
16.2试样制备
同5.2。
16.3试样提取
称取5g（精确至0.01g）试样于15mL具塞离心管中，加入10mL盐酸溶液（0.1mol/L），振荡均匀。将离心管置于100℃的沸水浴中，加热5min，冷却后，以5000r/min离心10min，上清液待净化。16.4试样净化
将上清液过已活化好的C1.固相萃取柱，收集流出液，用水定容至10mL。准确吸取1mL（相当于0.5g试样）于超滤离心管中离心，滤液供液相色谱测定。9
空白试验
除不加试样外，采用与试样相同的操作步骤，得到空白溶液。16.6
仪器参考条件
液相色谱参考条件
色谱柱：Cs柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或性能相当者；温度：30℃；
流动相：流动相A、流动相B和流动相C（乙睛）：流动相梯度洗脱.详见表1：
表1流动相梯度洗脱
时间/min
流动相A/%
流动相B/%
流动相C/%
柱后衍生：反应温度为50℃反应液流速（单位为mL/min），梯度见表2；表2柱后衍生反应液流速梯度
反应液
氧化液
乙酸溶液（1mol/L）
荧光检测：激发波长330nm，发射波长390nm；进样量：100μl。
16.7标准曲线的制作
GB5009.213—2016
流速/（mL/min）
单位为毫升每分钟
将不同浓度混合标准溶液分别注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。麻痹性贝类毒素标准溶液的液相色谱图见图E.1。16.8试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中麻痹性贝类毒素的质量浓度。
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GB5009.213—2016
食品安全国家标准
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB 5009.213—2016
本标准代替GB/T5009.213—2008《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》、GB/T23215—2008《贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法》、SC/T3023一2004《麻痹性贝类毒素的测定生物法》、SN0352—1995《出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法》、SN/T1735—2006《进出口贝类产品中麻痹性贝类毒素检验方法高效液相色谱法》和SN/T1773一2006《进出口贝类中麻痹性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附试验法》。本标准与GB/T5009.213—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定”；增加了酶联免疫吸附法；
增加了液相色谱-串联质谱法。
1范围
食品安全国家标准
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
GB5009.213—2016
本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素测定的小鼠生物法，酶联免疫吸附方法，液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。
本标准适用于牡蛎、扇贝等贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的检测小鼠生物法
2原理
用盐酸提取贝类中麻痹性贝类毒素（PSP）。记录小鼠腹腔注射提取液后的死亡时间，根据麻痹性贝类毒素致小鼠死亡时间与鼠单位关系的对照表查出鼠单位（MU)，并按小鼠体重对鼠单位进行校正得到校正鼠单位（CMU），计算得到每100g样品中PSP的鼠单位。以石房蛤毒素作为标准，将鼠单位换算成毒素的微克数，计算每100g贝肉中的PSP微克数。测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素总量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
3.1.1氢氧化钠(NaOH)。
3.1.2盐酸（HCI）。
3.1.3无水乙醇（CH.CHOH)。
3.2试剂配制
氢氧化钠溶液（0.1mol/L)：将4.0g氢氧化钠溶于1L水中。3.2.1
3.2.2盐酸溶液（0.18mol/L)：将15.5mL盐酸用蒸馏水稀释至1L。3.2.3盐酸溶液（5mol/L）：将45mL盐酸用水稀释至100mL。3.2.4酸性乙醇溶液：量取无水乙醇200mL用水稀释至1000mL，混匀.用盐酸溶液（5mol/L）调节pH至2.0~4.0。
3.3标准品
石房蛤毒素标准品（STX.C1.H1-N，O，：2HCI，CAS号35554-08-6）：纯度≥98.0%3.4标准溶液的配制
3.4.1石房蛤毒素标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量STX标准品，用酸性乙醇溶液溶解并定容1
配制成STX的质量浓度为100ug/mL的标准储备液GB5009.213—2016
3.4.2石房蛤毒素标准工作液（1μg/mL）：准确吸取1mlL石房蛤毒素标准储备液（100μg/mL），用水稀释，用盐酸溶液（5mol/L）调节pH至2.0～4.0.用水定容至100mL。该标准工作液于0℃～4℃下可保存30d。
3.5材料
3.5.1小鼠：体重为19g～21g的健康ICR系雄性小鼠。3.5.2pH计或pH试纸。
4仪器和设备
均质器。
4.2分析天平：感量为0.1g和0.0001g。4.3离心机：转速2000r/min。
5分析步骤
注：为避免毒素的危害，应戴手套进行操作。移液管及移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在次氯酸钠溶液（5%）中浸泡1h以上以使毒素分解。对于动物实验过程中产生的污水、废弃物及动物户体处理，应参照GB14925执行。
5.1样品采集
从2kg以上样品中采取足够贝类个数，去壳使贝肉达200g以上。不能及时送检的新鲜贝类，开壳将贝肉分离，将沥水后的200g贝肉放人200mL盐酸溶液（0.18mol/L)中，置4℃保存，备检。5.2试样制备
5.2.1牡蛎、蛤及贻贝
用清水将贝类样品外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破贝体。严禁加热或用麻醉剂开壳。收集约200g贝肉分散置于筛子中沥水5min（不要使肉堆积），捡出碎壳等杂物，将贝肉均质备用5.2.2扇贝
取可食部分用作检测，按5.2.1均质后备用。5.2.3冷冻贝类
在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）自然融化，按5.2.1开壳、淋洗、取肉、均质、备用。5.2.4贝类罐头
将罐内所有内容物（肉及液体)充分均质。如果是大罐，将贝肉沥水并收集沥下的液体分别称重并存放固形物和汤汁，将固形物和汤汁按原罐装比例混合，均质后备用，5.2.5用酸保存的贝肉
沥去酸液，分别存放贝肉及酸液备用。2
5.2.6贝肉干制品
GB5009.213—2016
干制品可于等体积盐酸溶液（0.18mol/L)中浸泡24h～48h(4℃冷藏），沥去酸液，分别存放贝肉及酸液备用。
5.3PSP标准品对照试验
5.3.1PSP标准工作液的配制
用10mL、15mL、20mL、25mL和30mL水分别稀释10mL石房蛤毒素标准工作液，配制成系列浓度的标准稀释液。
5.3.2中位数死亡时间的PSP标准工作液选择取按5.3.1配制的系列浓度的标准稀释液各1mL，腹腔注射小鼠数只，选择中位数死亡时间为5min～7min的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求，还需以1mL水的增减量进行补充稀释试验每只小鼠试验前称重，以10只小鼠为一组，用中位数死亡时间在5min～7min范围内的两个浓度的标准稀释液注射小鼠，测定并记录每只小鼠腹腔注射完毕至停正呼吸的所需死亡时间5.3.3毒素转换系数(CF)的计算
5.3.3.1小鼠中位数死亡时间的选择计算5.3.2中所选择浓度的标准稀释液受试组的中位数死亡时间。弃去中位数死亡时间小于5min或大于7min的受试组；选择中位数死亡时间在5min～7min的受试组，该受试组中可允许有个别小鼠的死亡时间可小于5min或大于7min。5.3.3.2校正鼠单位（CMU)的计算对于所选定的中位数死亡时间为5min～7min的受试组，根据附录A查得该组中每只小鼠死亡时间所对应的鼠单位（MU），再根据附录B查得组中每只小鼠体重所对应的体重校正系数，同一只小鼠的体重校正系数与鼠单位相乘得到该只受试小鼠的校正鼠单位（CMU）。5.3.3.3毒素转换系数(CF)的计算单只小鼠的毒素转换系数（CF)按式(1)计算：CF=CMU
式中：bzxZ.net
CF—毒素转换系数，单位为微克每毫升（μg/mL）；——每毫升STX标准稀释液中的毒素含量，单位为微克每毫升（μg/mL）CMU-—校正鼠单位。
得到单只小鼠的毒素转换系数（CF)后，再计算每组10只小鼠的平均CF值，即为组内毒素转换系数（CF,）。
5.3.3.4组间毒素转换系数（CF,)的计算取不同受试组的组内毒素转换系数的平均值，即为组间毒素转换系数（CF，）。以组间毒素转换系数进行试样毒力的计算。
5.3.3.5CF值定期检查
GB5009.213—2016
如PSP检测间隔时间较长，每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小鼠，重新测定CF值。如果一周有几次检测，则用中位数死亡时间5min～7min的标准稀释液每周检查一次，测得的CF值应在原测定CF值的土20%范围内。若结果不符，则用同样的标准稀释液另外注射5只小鼠，综合之前注射的5只小鼠的结果，计算出CF值。并用同样的标准稀释液注射第二组10只小鼠，将第二组求出的CF值和第一组的CF值进行平均，即为一个新的CF值。重复检查的CF值通常在原结果的土20%之内，若经常发现有较大偏差，在进行常规检测前应调查该方法中是否存在可变影响因素。5.4试样提取
取100g试样于烧杯中，加盐酸溶液（0.18mol/L)100ml充分搅拌，均质，调节pH至2.0~4.0，必要时，可逐滴加入盐酸溶液（5mol/L)或氢氧化钠溶液（0.1mol/L)调节pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。将混合物加热煮沸5min，冷却至室温，移至量筒中并稀释至200mL：调节pH至2.0～4.0。
将混合物倒回烧杯，搅拌均匀，自然沉降至上清液呈半透明状，不堵塞注射针头即可，必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min，或用滤纸过滤。收集上清液备用。5.5小鼠试验
取19.0g～21.0g健康ICR雄性小鼠6只，称重并记录重量。随机分为实验组和空白对照组两组，每组3只。
对每只实验组小鼠腹腔注射1mL试样提取液，对每只空白对照组腹腔注射1mL盐酸溶液(0.18mol/L）。注射过程中若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射完毕时间，仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间（到小鼠呼出最后一口气止）。若注射试样提取液后，1只或2只小鼠的死亡时间大于7min，需再注射至少三只小鼠。若小鼠的死亡时间小于5min，稀释试样提取液后，再注射3只小鼠，直至小鼠在5min～7min内死亡；稀释试样提取液时，需逐滴加人盐酸溶液（0.18mol/L)调节pH至2.0～4.0。6分析结果的表述
6.1以质量分数计的PSP毒力的计算与结果表述6.1.1以质量分数计的PSP毒力的计算每100g试样中PSP的含量按式（2)计算：X=CMU, XCF XDF X200
式中：
每100g样品中PSP的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；CMU
试样受试组小鼠的中位数校正鼠单位；CF,
组间毒素转换系数，单位为微克每毫升（μg/mL)；稀释倍数；
试样提取液的体积，单位为毫升（mL）。（2）
注：根据检测样品受试组的小鼠死亡时间，查出附录A对应的鼠单位；根据附录B查出小鼠体重所对应的体重校正系数，两者相乘得到该只小鼠的CMU。选取受试组中3只小鼠CMU的中位数，即为CMU1。4
6.1.2以质量分数计的PSP毒力的结果表述GB 5009.213—2016
若空白对照组小鼠正常，则报告待测样品中PSP毒素含量为：XX×μg/100g。6.2以MU计的PSP毒力的计算与结果表述6.2.1以MU计的PSP毒力的计算
每100g试样中以MU计的PSP毒力按式（3计算：Y=CMUXDFX200
式中：
每100g样品的MU值，单位为鼠单位每百克（MU/100g）；CMU,
实验组小鼠的中位数校正鼠毒力单位；DF
稀释倍数；
试样提取液的体积，单位为毫升（mL）。注：对于取得PSP标准品有困难的实验室，可按式（3)计算以MU计的PSP毒力。6.2.2
以MU计的PSP毒力的判断与结果表述在空白对照组小鼠正常的情况下进行如下判断和表述：·（3）
若实验组中位数死亡时间小于5min，则应对样品提取液进行稀释，再选取3只小鼠进行试验，直至得到中位数死亡时间为5min～7min为正，根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位毒力为：X××MU/100g。若实验组中位数死广时间天于7min，则直接计算确定样品鼠单位毒力，报告该样品的鼠单位毒力为：×××MU/100g。
若实验组中所有小鼠在观察15min内均不死亡，可报告该样品的鼠单位毒力小于400MU/100g。酶联免疫吸附法
7原理
游离麻痹性贝类毒素与其酶标记物竞争麻痹性贝类毒素抗体，同时麻痹性贝类毒素抗体与捕提抗体连接。没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。用酶标仪在450nm波长下测量微孔溶液的吸光度值，试样中麻痹性贝类毒素含量与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。8试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水8.1试剂
8.1.1盐酸(HCI)。
8.1.2十二水合磷酸氢二钠（NazHPO,·12H2O）。8.1.3氯化钠(NaCI)。
8.1.4氯化钾（KCI)。
8.1.5磷酸二氢钾（KH,PO,)。
8.1.6吐温-20（CsHi,O26）。
8.1.7牛血清白蛋白（BSA)。
8.1.8酶标记物。
8.1.9麻痹性贝类毒素抗体。
过氧化氢（H,O2）。
3.3,5,5-四甲基联苯胺（TMBCH2N,）。硫酸（H,SO,)。
试剂配制
盐酸溶液（0.1mol/L）：量取9mL盐酸，用水稀释至1000mL。8.2.2
盐酸溶液（5mol/L）：量取450mL盐酸，用水稀释至1000mL。GB5009.213—2016
8.2.3磷酸盐缓冲液（PBS溶液，pH7.4）：分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯化钾0.20g.加水溶解并定容至1000mL。8.2.4抗体稀释液：称取1.0gBSA，加PBS溶液溶解并定容至1000mL。8.2.5酶标记物工作液：用抗体稀释液将酶标记物稀释至工作浓度8.2.6麻痹性贝类毒素抗体工作液：麻痹性贝类毒素抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度8.2.7洗脱液：吸取0.5mL吐温-20，用PBS溶液稀释至1000mL。8.2.8硫酸溶液（1mol/L）：吸取53.2mL硫酸，缓缓加至盛有500mL水的烧杯中，并用水定容至1000mL，混匀。
8.3标准品
石房蛤毒素（STX.CiHi,N,O42HCICAS号35554-08-6）标准溶液8.4
标准溶液配制
标准系列工作液配制：准确吸取适量体积的石房蛤毒素标准溶液用PBS溶液（pH7.4）稀释.配制成质量浓度分别为0μg/L，2.5uμg/L.5μg/L，10μg/L.20μg/L，40μg/L的标准系列工作液。现用现配。
8.5材料
包被有麻痹性贝类毒素捕提抗体的微孔板注：商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准，参见附录C。9仪器和设备
9.1酶标仪。
9.2均质器。
离心机：转速6000r/min。
分析步骤
10.1样品采集
同5.1。
10.2试样制备
同5.2。
10.3试样提取
GB5009.213—2016
称取10g（精确至0.1g）试样，加入70mL盐酸溶液（0.1mol/L)如为较干燥的贝肉，加人140mL盐酸溶液（0.1mol/L），煮沸并搅拌5min4℃条件下6000r/min离心10min，上清液用盐酸溶液（5mol/L）调节pH至4.0以下。取100μL提取液，加人900μLPBS溶液（pH7.4）.混匀，取50μL进行测定。
10.4测定
将包被有麻痹性贝类毒素捕捉抗体的微孔条插人微孔架并做好标记，其中包括空白对照孔、标准液孔和样液孔，分别做平行孔。向空白对照孔加入50uL磷酸盐缓冲液，标准液孔加入50μL麻痹性贝类毒素标准系列工作液，样液孔加人50uL样液。加入50μL麻痹性贝类毒素酶标记物至每个微孔，轻轻混合；再加人50uL麻痹性贝类毒素抗体至每个微孔，彻底混合，用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发，20℃～25℃黑暗避光处孵育15min。孵育结束后，倒去孔中液体，每个微孔注入250uL洗脱液冲洗，翻转微孔板，倾去孔内液体，再重复以上洗板操作5次，在吸水纸上拍干。每孔加100uL过氧化氢和TMB.充分混合.20C～~25℃黑暗避光处孵育15min。每孔加人100uL硫酸溶液（1mol/L）迅速混匀，终止反应，在10min内测量并记录450nm波长下的吸光度值。若测定的样液的质量浓度超出标准曲线的线性范围，可扩天稀释倍数后重新进行测定。10.5标准曲线的制作
以麻痹性贝类毒素标准系列工作液质量浓度以10为底的对数值为横坐标，以式（4)计算的百分比吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，麻痹性贝类毒素标准液和样液的百分比吸光度值按式（4）计算：s
A-s。
×100%
式中：
一百分比吸光度值；
麻痹性贝类毒素标准液或样液的平均吸光度值；-0ug/kg的麻痹性贝类毒素标准液的平均吸光度值。So
11分析结果的表述
试样中麻痹性贝类毒素的含量按式（5)计算：X=pxvxf
式中：
X—试样中麻痹性贝类毒素的含量，单位为微克每克（μug/g)；p
.（4)
··（5）
由标准曲线得到的试样待测液中麻痹性贝类毒素的质量浓度，单位为微克每毫升（pμg/mL）；试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；稀释倍数：
试样的质量，单位为克（g）。
注：任何麻痹性贝类毒素含量值大于800ug/kg的样品即被认为是有害的，对人类食用不安全。7
2其他
本方法的定量限为50ug/kg。
13原理
液相色谱法
GB 5009.213—2016
试样中的麻痹性贝类毒素经盐酸溶液（0.1mol/L)提取.C1固相萃取柱和超滤离心净化，液相色谱分离，在线柱后衍生荧光检测，外标法定量。14
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。14.1试剂
乙腈（CH.CN）：色谱纯。
无水乙酸(CH,COOH)。
盐酸（HCI)。
庚烷磺酸钠（C,HisNaO,S)。
磷酸(HPO,）。
二水合高碘酸（HIO，·2H2O)。磷酸氢二钾（K,HPO,）。
氢氧化钾(KOH)。
氨水(NH·H,O)。
试剂配制
庚烷磺酸钠溶液（0.1mol/L）：称取20.2g庚烷磺酸钠，用水溶解并稀释至1000mL。磷酸溶液（0.5mol/L）：称取49.0g磷酸，用水溶解并稀释至1000mL。磷酸氢二钾溶液（0.25mol/L）：称取43.5g磷酸氢二钾，用水溶解并稀释至1000mL氢氧化钾溶液（1mol/L）：称取56.1g氢氧化钾，用水溶解并稀释至1000mL。高碘酸溶液（0.5mol/L）：称取114.0g二水合高碘酸，用水溶解并稀释至1000mL。乙酸溶液（1mol/L）：称取60.0g无水乙酸，用水溶解并稀释至1000mL。乙酸溶液（0.01mol/L）：量取10.0mL乙酸溶液（1mol/L），用水稀释至1000mL。盐酸溶液（0.1mol/L)：量取9.0mL盐酸，用水稀释至1000mL。流动相A：量取15.0mL庚烷磺酸钠溶液（0.1mol/L）、8.5mL磷酸溶液（0.5mol/L），用约450mL水稀释，用氨水调pH至7.2，用水定容至500mL，过0.45μm水相微孔滤膜流动相B：量取20.0mL庚烷磺酸钠溶液（0.1mol/L）、45.0mL磷酸溶液（0.5mol/L），用约14.2.10
450mL水稀释.用氨水调节pH至7.2.用水定容到500mL.过0.45μm水相微孔滤膜。14.2.11
氧化液：量取10.0mL高碘酸（0.5mol/L）、100mL磷酸氢二钾溶液（0.25mol/L），用约450mL水溶解，用氢氧化钾溶液（1mol/L）调节pH至9.0，用水稀释至500mL。8
14.3标准品
GB5009.213—2016
麻痹性贝类毒素GTX1，4、GTX2，3、dcGTX2，3、GTX5、neoSTX、STX、dcSTX标准溶液，避光保存于一20℃以下。标准品相关信息参见附录D。14.4标准溶液配制
14.4.1麻痹性贝类毒素标准储备液：准确吸取适量麻痹性贝类毒素标准溶液，用乙酸溶液（0.01mol/L）稀释并定容，配制成一定浓度的标准储备液，避光保存于一20℃以下。14.4.2麻痹性贝类毒素混合标准溶液：分别准确吸取适量各麻痹性贝类毒素标准储备液，用乙酸溶液(0.01mol/L)稀释并定容，配制成所需质量浓度的混合标准溶液.现用现配。3麻痹性贝类毒素混合标准工作液：准确吸取适量麻痹性贝类毒素混合标准溶液，用乙酸溶液14.4.3
（0.01mol/L）稀释并定容，配制成混合标准工作液，相关信息见附录D。14.5材料
Cl：固相萃取柱：500mg/3mL，或性能相当者。使用前依次用6mL甲醇和6mL水活化14.5.2
超滤离心管：4mL，10KD。
微孔滤膜：0.45um，水相，
仪器和设备
液相色谱仪：配有荧光检测器，柱后衍生反应装置离心机：转速≥2000r/min。
固相萃取装置。
涡旋振荡器
恒温水浴锅。
pH计。
分析步骤
样品采集
同5.1。
16.2试样制备
同5.2。
16.3试样提取
称取5g（精确至0.01g）试样于15mL具塞离心管中，加入10mL盐酸溶液（0.1mol/L），振荡均匀。将离心管置于100℃的沸水浴中，加热5min，冷却后，以5000r/min离心10min，上清液待净化。16.4试样净化
将上清液过已活化好的C1.固相萃取柱，收集流出液，用水定容至10mL。准确吸取1mL（相当于0.5g试样）于超滤离心管中离心，滤液供液相色谱测定。9
空白试验
除不加试样外，采用与试样相同的操作步骤，得到空白溶液。16.6
仪器参考条件
液相色谱参考条件
色谱柱：Cs柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或性能相当者；温度：30℃；
流动相：流动相A、流动相B和流动相C（乙睛）：流动相梯度洗脱.详见表1：
表1流动相梯度洗脱
时间/min
流动相A/%
流动相B/%
流动相C/%
柱后衍生：反应温度为50℃反应液流速（单位为mL/min），梯度见表2；表2柱后衍生反应液流速梯度
反应液
氧化液
乙酸溶液（1mol/L）
荧光检测：激发波长330nm，发射波长390nm；进样量：100μl。
16.7标准曲线的制作
GB5009.213—2016
流速/（mL/min）
单位为毫升每分钟
将不同浓度混合标准溶液分别注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。麻痹性贝类毒素标准溶液的液相色谱图见图E.1。16.8试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中麻痹性贝类毒素的质量浓度。
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