GB/T 33682-2017 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 GB/T33682-2017 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

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GB/T33682—2017
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则
General microganism identification method with matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry2017-05-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。GB/T33682—2017
本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、中国测试技术研究院、深圳出人境检验检疫局、卫生部北京医院、梅里埃诊断产品（上海）有限公司、北京威泰科生物技术有限公司。本标准主要起草人：彭丽葬、周李华、姜雯、吕敬章、王志强、张秀珍、孔鲁商、胡云建、王海宽、陆俊杰、张春红、王科、徐凤霞、张滨滨。Hii KAoi KAca
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1范围
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则
本标准规定了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物的方法通则，GB/T33682—2017
本标准适用于各类从事微生物相关检验工作实验室对样品中的微生物进行快速鉴定以及研究，可鉴定微生物种属。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.10一2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18204.3一2013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用手本文件。3.1
全微生物蛋白质指纹图谱microbialproteinfingerprinting未经处理的微生物菌苔（如固体培养基上的菌落），直接涂于靶板上，待干燥后加上基质混合，全细菌可溶性蛋白与基质形成共结晶体后通过真空飞行时间管获取不同质电荷比的蛋白分子质谱指纹图谱。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CHCA：a-氟基-4羟基肉桂酸（a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid）DHB：2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoicacid)MALDI-TOFMS：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)5原理
常见微生物都由其区别于其他种类的特殊蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱，这是由物种的遗传特性所决定的，受外界环境条件等影响较小。样品（来自痰、血、体液、拭子等临床样本及食品、化妆品、药品及环境等）经适当的处理，在固体培养1
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基上培养、分离出单个菌落后，直接点样至靶板并将其放人基质辅助激光电离解析飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）内，经离子化按照质量/电荷（m/）比值大小分离，将采集的数据与微生物指纹图谱库对照鉴定。
6试剂与标准品
除非有特殊说明，仅使用色谱纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。甲酸（HCOOH)。
6.2乙腈(CH.CN)。
乙醇(CH.CH2OH)。
6.4三氟乙酸（CF:COOH)。
5磷酸盐缓冲液：pH7.2。
a-氰基-4羟基肉桂酸(C。H,NO.），光谱纯。6.6
6.72,5-二羟基苯甲酸（C,HO)，光谱纯。3血琼脂培养基：按照GB4789.10—2016中A.2的规定执行。6.8
9沙氏琼脂培养基：按照GB/T18204.3—2013中4.2.2.1的规定执行。6.9
6.10标准菌株：ATCC8739大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）。7仪器与设备
MALDI-TOFMS。
二级生物安全柜。
7.3恒温培养箱：36℃士1℃、25℃士1℃。7.4离心机：12000r/min
5旋涡混合器。
5显微镜。
7.7微量移液器及枪头。
3一次性或重复使用靶板。
91μ接种环。
8试验方法
微生物的培养
8.1.1培养前处理
痰、血、体液、拭子等临床样本经采集后直接接种。其他固体样品需粉碎，加人无菌磷酸盐稀释液溶解，液体样品可不经过溶解。
8.1.2微生物培养
一般细菌划线接种血琼脂培养基，36℃C土1℃培养24h士2h；酵母划线接种沙保弱葡萄糖琼脂培养基，25℃士1C培养2d～3d；其他类型微生物，如霉菌、分枝杆菌和诺卡氏菌等，可参照相关标准中规定的培养基和培养方法执行。2
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8.2样品处理（点靶）
8.2.1一般细菌和酵母菌
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鉴定细菌时，直接使用1μL接种环挑取单个菌落，点在样品靶板孔中，涂抹均勾并在室温自然晾干。如果鉴定酵母，需要用微量移液器吸取0.5μL25%FA溶液（破坏细胞壁，使蛋白溶出）。用微量移液器吸取1μL基质溶液，与样品混合，自然晾干，形成结晶（基质可选择CHCA，DHB中的一种）。8.2.2霉菌
将无菌棉拭子在去离子水中沾湿后，从沙氏培养基上刮取1cm～2cm霉菌菌落，转移至装有300μL超纯水的2mL离心管中。向离心管中加人900μL乙醇，用漩涡混合器混3s5s。混合后用离心机在10000r/min下离心2min后去除上清液，置于室温干燥。加人40μL70%甲酸漩涡混合3s~5s，之后再加人40L乙睛游涡混合3s~5s，用离心机在10000r/min离心2min后，用微量移液器吸取1L样品加在样品靶板孔中，待室温干燥后再加人1基质溶液，在室温下自然晾干。8.3生物防护
所有标本微生物培养物以及接种后的实验材料均应在符合GB19489规定的相应生物安全等级的实验室条件下进行操作，并适当处置。8.4仪器条件
8.4.1仪器：MALDI-TOFMS
激光能量：每激光束能量100叫，激光能量可从0%~100%范围调节。8.4.2
8.4.3质谱扫描范围：2000Da~20000Da。8.4.4微生物指纹图谱库：VMSPlusDatabase\或同等类型数据库。8.5质控菌株校准
将标准菌株ATCC8739大肠埃希氏菌转种至血琼脂培养基上36℃土1C培养24h土2h。每次检测样品前推荐使用ATCC8739大肠埃希氏菌的11个特征峰校准飞行时间质谱。8.6鉴定
将样品靶板放人仪器内，设定合适的激光能量，质谱扫描范围等参数，开始质谱数据采集。数据采集完成后，将经过处理的质谱数据自动/手动导人本地微生物指纹图谱库即微生物鉴定系统，并在鉴定系统中鉴定结果。
8.7结果判读
图谱数据经指纹图谱库运算后直接显示菌株的鉴定结果，并以颜色显示每个涂菌点位的鉴定结果的置信水平。
9结果报告
参照微生物质谱鉴定系统的鉴定置信水平报告微生物鉴定结果。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。
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基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则
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开本880×12301/16印张0.5字数9千字2017年5月第一版2017年5月第一次印刷*
书号：1550661-56288
8定价14.00元
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